谷氨酸对平邑甜茶根系生长的影响及其离子型受体同源基因的克隆

论文摘要

氮素是果树必需矿质元素中的核心元素,而根系是农业生产措施的主要作用中心。平邑甜茶（Malus hupehensis Rehd. var. pingyiensis Jiang）是苹果生产上常用的优良砧木,为了确定氮素供应与根系生长之间的关系,本实验研究了硝态氮、铵态氮与谷氨酸对其根系生长的影响;为从分子水平上探讨谷氨酸的作用机理,利用GenBank中的EST序列设计引物,从平邑甜茶新根中分离到了谷氨酸受体同源基因MhGLR3.6,并采用荧光定量PCR初步研究了其表达特性,构建了pBI121- MhGLR3.6反义表达载体,采用农杆菌侵染法转化‘皇家嘎拉’苹果（Malus domestica Borth.cv. Royal Gala）。主要结果如下:1.平邑甜茶植株的茎叶生物量及根系生物量在1 mmol/L NO3-处理时均达到最高水平,分别为对照的216.7%和138.5%;对侧根生长而言,侧根长度与侧根数量也在1 mmol/L NO3-处理时最高,分别比对照增加168.9%和100.9%;但超过1 mmol/L后随浓度升高持续下降;NH4+处理的以上各指标表现相同的趋势,但相同供氮浓度时,NH4+处理的低于NO3-处理。随供氮浓度的增加,植株冠根比呈持续增加趋势。对主根而言,氮素供应能明显促进主根生长,但各浓度处理间差异不显著。不同浓度间氮素处理的平邑甜茶根系平均直径差异不显著,NO3-与NH4+处理的根系直径明显高于对照。采用肥料袋控缓释方法研究氮素对平邑甜茶根系生长的影响,结果显示局部供应NO3-与NH4+均能显著增加侧根密度。2.在0-50μmol/L的范围内,随供应L-谷氨酸浓度的提高,平邑甜茶主根长度显著增加,供应50μmol/L L-谷氨酸的主根长度为0μmol/L的181%;而随供应L-谷氨酸浓度的继续提高,主根长度则急剧下降,到1000μmol/L时降至最低点,仅为50μmol/L时的35.6%。较低浓度的L-谷氨酸处理（0-50μmol/ L）能刺激侧根长度的增加,50μmol/ L L-谷氨酸处理的侧根长度为对照的142%。继续增加L-谷氨酸的浓度,侧根长度明显受抑制,1 000μmol/ L的L-谷氨酸处理仅为对照的22.1%。供应0-100μmol/ L的L-谷氨酸能显著增加侧根的数量,以50μmol/ L时最高,为对照的184%;增加L-谷氨酸的浓度,侧根数量明显下降,1000μmol/ L时为对照的56.7%。3.利用谷氨酸受体基因同源序列设计简并引物,通过RT-PCR和SMART RACE PCR技术获得了平邑甜茶谷氨酸受体同源基因MhGLR3.6,GenBank注册号为EF432572。序列分析表明,MhGLR3.6 cDNA全长3 600 bp,含有2 838 bp的完整开放阅读框,编码946个氨基酸,预测分子量107.809 KDa。聚类分析发现,MhGLR3.6属于拟南芥GLRs家族中的第三亚家族,且与AtGLR3.6的同源关系最近。亲水性分析表明MhGLR3.6包含三个跨膜结构域（M1、M3、M4）,一个N末端信号肽Sp,一个凹膜结构域M2。Sp与M1、M3与M4之间分别为配体结合结构域GlnH1和GlnH2。4.荧光定量PCR结果显示,MhGLR3.6在根、茎、叶中均有所表达,且在叶中的表达量最高;L-谷氨酸和IBA处理能够诱导根中MhGLR3.6的表达。5.成功构建了pBI121- MhGLR3.6反义表达载体,并对‘皇家嘎拉’苹果进行了农杆菌介导的遗传转化。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1. 前言
• 1.1 氮信号
• 1.2 低浓度氮素对侧根生长的影响及 ANR1 基因的作用
• 1.3 高浓度硝酸盐对侧根发育的系统抑制
• 1.4 外源L-谷氨酸对主根生长及根系分枝的影响
• 1.5 L-谷氨酸的感知机制及离子型谷氨酸受体的作用
• 1.6 本研究的目的和意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料与处理
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.1.3 酶及生化试剂
• 2.1.4 PCR 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 供氮形态与水平试验
• 2.2.2 局部供氮试验
• 2.2.3 植物材料总 RNA 的提取
• 2.2.4 反转录cDNA 第一链的合成（用于3′RACE）
• 2.2.5 反转录cDNA 第一链的合成（用于5′RACE）
• 2.2.6 cDNA 全长基因序列的获得
• 2.2.6.1 3′端基因片段的克隆
• 2.2.6.2 5′RACE 获得5′端基因序列
• 2.2.6.3 MhGLR3.6 全长基因的克隆
• 2.2.7 DNA 片段与克隆载体的连接
• 2.2.8 凝胶电泳中 DNA 片段的回收
• 2.2.9 碱法小量质粒 DNA 的提取
• 2.2.10 DNA 序列测定
• 2.2.11 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
• 2.2.11.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.11.2 大肠杆菌感受态细胞的转化
• 2.2.12 根癌农杆菌 LBA4404 感受态细胞的制备与转化
• 2.2.12.1 感受态细胞的制备
• 2.2.12.2 冻融法农杆菌转化
• 2.2.13 基因组 DNA 提取（CTAB 法）
• 2.2.14 MhGLR3.6 反义表达载体的构建
• 2.2.15 实时荧光定量 PCR
• 2.2.16 ‘皇家嘎拉’苹果的转化
• 2.2.16.1 组织培养所用培养基
• 2.2.16.2 转化步骤
• 3. 结果与分析
• 3^-与NH₄⁺对平邑甜茶生长的影响'>3.1 供应不同水平的NO₃^-与NH₄⁺对平邑甜茶生长的影响
• 3.1.1 生物量及冠根比
• 3.1.2 主根生长
• 3.1.3 侧根生长
• 3.1.4 根系直径
• 3.2 不同供氮形态对平邑甜茶生长的影响
• 3.3 局部供氮对平邑甜茶侧根密度的影响
• 3.4 谷氨酸对平邑甜茶根系生长的影响
• 3.5 MhGLR3.6 3′基因片段的分离
• 3.6 MhGLR3.6 5′片段的分离
• 3.7 MhGLR3.6 编码基因的克隆
• 3.8 MhGLR3.6 基因的序列分析
• 3.9 基因的表达特性研究
• 3.9.1 MhGLR3.6 在不同组织中的表达
• 3.9.2 L-谷氨酸和IBA 对MhGLR3.6 表达的影响
• 3.10 转基因植株的获得
• 4. 讨论
• 4.1 不同供氮处理对平邑甜茶根系构型的影响
• 4.2 平邑甜茶谷氨酸受体同源基因的克隆、表达及转化
• 5. 结论
• 参考文献
• 致谢
• 硕士在读期间形成的论文