乙酰肝素酶在卵巢上皮性癌中的表达及促肿瘤转移机制的实验研究

论文摘要

卵巢癌是妇科三大恶性肿瘤之一,其中以上皮性癌最为多见,生长隐匿性极强,临床明确诊断时多数已有转移,在此过程中,细胞粘附,运动,细胞外基质（extracellularmatrix,ECM）和基底膜（basementmembrane,BM）的降解及新生血管的形成是决定因素,肿瘤细胞必须突破这一屏障,才有可能侵入临近组织或向别处转移。乙酰肝素酶（heparanase,HPA）是新近克隆出来的一种葡萄糖醛酸内切酶,能降解ECM和BM中的重要组成成分——硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparansulfateproteoglycan,HSPG）,直接促进肿瘤的浸润转移,同时通过降解HS释放并激活其结合的生长因子如碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血管内皮生长因子（VEGF）及各种酶等加速新生血管形成,从而促进肿瘤的浸润和转移。迄今为止,HPA是发现的唯一一个可以降解HS的酶,这使HPA成为研究抗肿瘤药物的极具吸引力的新靶点。实体肿瘤普遍存在低氧微环境,是肿瘤发展过程中必须经历的环境之一。为了适应低氧,处于快速增殖的肿瘤细胞很多基因的转录活性发生改变,研究已经发现低氧通过多种机制促进肿瘤的侵袭和转移,是多种肿瘤独立的不良预后之一。HIF-1（hypoxia inducible factor-1）是迄今为止发现的唯一一个特异性低氧状态下发挥活性的转录因子,由α亚单位（活性单位）和β亚单位（构成单位）组成异源二聚体,作为促红细胞生成素（EPO）增强子特异结合的由低氧诱导产生的DNA结合蛋白,是维持氧稳态,调节机体或细胞适应整体或局部缺氧、介导细胞生存的关键调控因子。目前为止,对于HPA与卵巢上皮性癌临床病理参数间关系的研究及不同生理、病理条件下HPA的表达及其功能的调节所知甚少。由于其特定的PH值活性,加之肿瘤特定的低氧微环境造成的局部PH值的改变,因而考虑低氧是否对HPA功能影响很有意义。国外研究表明,肿瘤细胞在低氧条件下穿透细胞基质的能力增强,但低氧及HPA的表达与卵巢肿瘤细胞侵袭力的关系国内一直未见报道。另外,低氧诱导因子-1是低氧激活的核转录因子,几乎调控了低氧所诱导的所有基因的转录,因而推测低氧是否可能通过HIF-1而影响HPA的功能,进而是否增强了卵巢癌的侵袭能力。深入探讨低氧状态下乙酰肝素酶在卵巢癌发生发展和转移中的作用机制及影响因素,进而探寻以乙酰肝素酶为靶点的有效治疗卵巢癌的思路及方法是卵巢癌临床治疗的一条新途径。本研究分两部分第一部分乙酰肝素酶在卵巢上皮性癌中的表达及其临床意义目的:探讨乙酰肝素酶在人类卵巢上皮性癌中的表达及与临床病理特征间的关系。材料和方法:采用western-blot技术检测65例不同临床分期、不同分化程度的卵巢上皮性癌中乙酰肝素酶的蛋白表达情况,采用x2检验及Fisher精确概率检验分析其表达水平与临床病理因素之间的关系。结果:1、在65例卵巢癌标本中表达率为70.8%,在28例卵巢良性肿瘤中的表达率为17.9%,二者差异有显著性（P＜0.01）。2、不同临床分期的肿瘤组织中阳性表达率之间的差异有统计学意义性,淋巴结转移组的表达率与无淋巴结转移组差异显著（P＜0.01）。3、不同年龄组、不同分化程度和不同组织学类型的卵巢癌组织中其阳性表达率无显著性差异（P＞0.05）。结论:1、HPA在卵巢上皮性癌组织中表达明显高于良性肿瘤组织。2、HPA的表达与有无淋巴结转移,临床分期密切相关,有淋巴结转移组明显高于无淋巴结转移组,临床分期越高,其表达率越高。与年龄、分化程度及组织学类型无关。3、联合检测HPA的表达对判断卵巢上皮性癌的临床进展有一定的参考价值。第二部分低氧对卵巢癌细胞株SKOV3中乙酰肝素酶表达的影响及相关机制目的:通过卵巢癌细胞株SKOV3体外培养,研究低氧下HPA的表达及其侵袭力的变化;在此基础上进一步探讨低氧下HIF-1α与HPA间的相互调控关系。材料与方法:体外常规培养、传代卵巢浆液性囊腺癌细胞株SKOV3,分别于低氧12h、24h、36h采用RT-PCR和western-blot技术检测HPA、HIF-1α的mRNA和蛋白变化,采用基质凝胶侵袭实验检测各组细胞侵袭力;应用HIF-1α抑制剂雷帕霉素后,再次检测上述mRNA和蛋白的变化,进而探讨HPA与HIF-1α间的相互调控关系。结果:HPA mRNA及蛋白表达12h、24h、36h均升高（分别为对照组的2.06,1.63,1.78倍和2.01,3.84,4.28倍）,差异具有显著性意义（P＜0.01）。不同组别侵袭细胞数比较差异有统计学意义（P＜0.01）,低氧时HPA蛋白表达的变化与细胞侵袭力的变化呈正相关（r=0.9863,P＜0.01）。低氧各时间段HIF-1αmRNA变化无统计学意义,而其12h蛋白表达明显高于对照组（4.7倍）且差异有显著性意义（P＜0.01）,24h、36h HIF-1α蛋白量持续增高,应用HIF-1α抑制剂雷帕霉素后,HPA mRNA及蛋白表达在相应点的峰值均降低,用药前后差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论:1、低氧可显著提高SKOV3细胞HPA mRNA及蛋白的表达及其细胞的侵袭力。2、HPA蛋白的表达与细胞侵袭力的变化呈正相关,表明低氧下细胞侵袭力与HPA表达水平增高有密切关系。3、低氧下HPA的表达增加是通过HIF-1α通路实现的。HPA在卵巢上皮性癌组织中表达明显增高,且随着临床期别的增高,其表达率越高,有淋巴结转移时表达明显高于无淋巴结转移,联合检测HPA的表达对判断卵巢上皮性癌的临床进展有一定的参考价值;HPA表达水平逐渐增高的一条通路是通过低氧下HIF-1α调节实现的,且这种增高与肿瘤细胞侵袭力的增加有密切关系。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 第一部分 乙酰肝素酶在卵巢上皮性癌中的表达及其与临床意义
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分 低氧对卵巢癌细胞株SKOV3中乙酰肝素酶表达的影响及相关机制
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图
• 参考文献
• 致谢
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