蟹多拷贝串联重组金属硫蛋白基因的原核表达载体构建及表达

论文摘要

金属硫蛋白由于富含Cys残基（30%以上）且Cys残基都是以还原态结合金属离子存在等独特的理化性质,使得其在抗氧化作用、清除自由基和重金属解毒等方面具有独特的功能,从而在科学研究上引起了人们高涨的热情,在实际应用中具有极高的应用价值,尤其在医药、保健等领域。但目前金属硫蛋白主要源于动物内脏提取物,存在提取量小、制备成本高、部分重金属污染等方面的问题。为解决这一难题,在前期研究成果的基础上,本研究利用原核表达载体pET-15b和大肠杆菌BL-21（DE3）PlysS构建了含2拷贝和3拷贝的中华绒螯蟹金属硫蛋白基因的多拷贝串联重复原核表达系统。在摸索了最佳培养和诱导条件后,成功高效地表达了含2拷贝和3拷贝串联的金属硫蛋白,表达主要以包涵体的形式出现,且目标蛋白表达量分别占菌体总蛋白量的40%和45%。通过发酵罐发酵技术高效地获取了目的蛋白,验证了工业化大规模制备金属硫蛋白的可行性,成功解决了金属硫蛋白的大量廉价获得难题,为后续的蛋白理化性质,生物学功能研究和应用打下了基础。同时,为获得单体目标蛋白,设计时在各串联拷贝分子之间添加了特异性的酶和化合物切割位点,以方便后续的蛋白分子切割。但是结果显示,切割效果并不是那么明显,推测与分子内或分子间二硫桥结构的形成有关。由于在菌体内表达的目标蛋白产物大多数为包涵体,实验用6M的盐酸胍溶解包涵体,利用盐酸胍密度梯度透析（4M、2M盐酸胍、0.01M PBS）对蛋白进行复性,用DPPH比色法测定了复性后目标蛋白的活性,结果显示复性效果有待进一步提高,复性方法、条件有待进一步深入研究。目的构建中华绒螯蟹金属硫蛋白基因多拷贝串联重复原核表达载体,实现高效表达目的基因。对包涵体进行蛋白复性。1、pET-1MT、pET-2MT、pET-3MT重组多拷贝重复表达MT原核载体的和基因工程菌的构建1)引物设计:由于要插入多个拷贝数的目的基因,因此在设计引物时,要考虑插入片段的顺序问题,既逐个片段插入。在设计第1对引物的时候,除在上游引物上添加一个内切酶位点外,于下游引物上添加2个了限制性内切酶位点,专为下一个片段的插入提供条件。类似的第2对引物的下游引物上也添加了特异性的限制性内切酶位点,专为第3个片段插入提供条件。在每条下游引物5’端添加一个特异性的蛋白切割位点,以满足实验或有的要求能将多串联拷贝数的目标蛋白切割成单体。2)常规PCR:分别以3对引物和本中心原有的重组质粒GST-MT为模板,通过常规PCR获得MT基因的CDS片段3份,各份片段之间的区别仅在于片段两端所带的限制性内切酶位点不完全相同。按照插入顺序的要求,分别标记为第1、2、3目的片段3) T-A克隆:将PCR扩增的3个片段分别与pMD19-T Simple Vector做T-A克隆,转化大肠杆菌BL-21,挑选阳性克隆,双酶切、测序鉴定,结果显示正确后将重组T载体依据所含的目的片段在预先设计时插入的顺序,标记为T1、T2、T3。4)亚克隆:选用原核表达载体pET-15b,建立融合6个His标签的金属硫蛋白基因多串联重复表达载体。用选定的第1组限制性内切酶特异性切割T1和原核表达载体pET-15b,胶回收目的片段,将带限制性内切酶粘性末端的第1目的片段通过T4DNA联接酶联接到原核表达载体pET-15b上,转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS,挑选阳性克隆双酶切、测序鉴定,结果显示完整地插入了目的基因片段后,标记为pET-1MT。类似地以第2组限制性内切酶切割T2和pET-1MT载体,胶回收目的片段,将带限制性内切酶粘性末端的第2目的片段插入原核表达载体pET-1MT上,双酶切、测序鉴定显示完整地插入了第2拷贝的目的基因片段后,标记为pET-2MT。类似地插入第3个片段,建立含3拷贝的目的基因的表达载体,标记为pET-3MT。2、原核表达摸索并确定最佳表达条件后。将构建好的基因工程菌在最佳条件下表达:LB培养基中[1%（m/v）Trytone,0.5%（m/v）Yeast Extact, 1%（m/v）NaCl,60μg/ml AMP,300uM ZnCl2 ],37℃,300r/min恒温振荡摇床培养至菌体OD值0.4-0.5,添加IPTG至终浓度1.0mM诱导蛋白表达,继续培养8h。3、SDS-PAGE分析表达产物:收集发酵液上清,菌体超声破碎后的上清,超声破碎后的沉淀行SDS-PAGE,观察目的条带。4、Western blot分析表达产物:收集发酵液上清,菌体超声破碎后的上清,超声破碎后的沉淀,用兔源抗His的一抗,做western blot鉴定与定量。5、包涵体蛋白纯化:低温离心收集发酵后的菌体,冰浴超声破碎菌体,低温高速离心收集包涵体沉淀,4M尿素洗涤。6、发酵罐大规模发酵获取目的蛋白。7、复性包涵体蛋白:包涵体蛋白经6M盐酸胍溶解后,加入DTT至终浓度200mM,在4℃环境中经过4M、2M盐酸胍浓度梯度透析后,再经0.1M PBS透析。8、DPPH比色法检测复性后蛋白活性:利用DPPH比色法测定复性金属硫蛋白的抗氧化活性,以检测目的蛋白复性效果。结果1、成功构建出含1拷贝、2拷贝和3拷贝的金属硫蛋白重复表达载体并转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS,顺利构建含1拷贝、2拷贝和3拷贝的金属硫蛋白重复原核表达系统。成功高效地表达了目的蛋白。2、4M尿素洗涤后获得了纯度较高的包涵体蛋白。3、SDS-PAGE电泳分析显示:在超声破碎后沉淀中出现明显条带,其分子量与预测一致,初步分析为目的蛋白。4、Western blot分析:超声破碎后沉淀里含有目的蛋白。多拷贝的金属硫蛋白分子进一步形成多聚体的迹象明显。5、发酵罐发酵高效获得了目的蛋白。6、PDDH比色法测定显示复性效果有待进一步提高。结论1、成功构建蟹多串联重复金属硫蛋白基因原核表达系统并获得高效表达,为后续研究奠定坚实基础。2、通过发酵罐发酵技术高效地获得了目的蛋白,充分验证了大规模制备目的蛋白的可行性。3、研究发现金属硫蛋白在体外表达能够形成复杂的分子内,分子间结构,这是普通蛋白所不常见的,提示了金属硫蛋白理化、生化性质的特殊性和复杂性,有必要对其进行更深入的探索,其包涵体复性条件有待进一步深入改善。

论文目录

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