水稻苗期黄绿叶基因YGL2的功能研究和垩白粒率QTL qPGWC-7候选基因的功能初步分析

论文摘要

本论文包括两部分研究内容,第一部分为水稻苗期黄绿叶基因YGL2（YELLOW-GREEN LEAF2）的图位克隆和功能分析,第二部分为水稻垩白粒率QTL qPGWC-7的精细定位和候选基因的功能初步分析。第一部分：在高等植物中,血红素加氧酶（Heme Oxygenase, HO）是血红素分解代谢的限速酶,它能够催化血红素的降解,从而合成光敏色素前体。之前已经有研究报道了水稻中血红素加氧酶在控制光周期,调节水稻开花中的作用。但是,其在调节水稻叶绿素合成中的作用仍然没有研究。本文中,我们从60Co辐射诱变的冈46B突变体中发现了一个苗期表现为黄绿叶的突变体,命名为ygl2。在自然条件下,大田中生长的ygl2突变体在苗期,叶片呈现黄绿色表型,3叶期时突变体黄化表型最为明显；随着植株的生长,突变体褪绿叶片逐渐转绿,到抽穗期基本恢复到野生型的正常绿叶表型。通过测定叶绿素的含量发现,三叶期突变体中叶绿素（Chl）和类胡萝卜素的含量显著降低,而叶绿素a/叶绿素b的比例明显增加,随着植株的生长,这种差异逐渐缩小。对叶片叶绿体的扫描电镜观察发现突变体中叶绿体基粒填充不完整,每个类囊体片层的数目显著减少,导致叶片中叶绿体发育不完全,因此叶片出现黄化表型。为研究引起叶片黄化的突变基因,我们构建了ygl2和日本晴的F2群体,遗传分析表明黄叶表型是由一个单隐性基因控制,利用图位克隆的方法将该基因定位在水稻第6染色体短臂两Indel标记In44和In39之间约66.8kb的区间内。测序分析发现,在该区间内的一个编码血红素加氧酶的基因的第1外显子插入了约7kb的片段,导致突变体中编码的氨基酸的改变并且引起该基因的表达量显著下降；转基因互补实验和RNAi结果均表明该基因的突变导致了黄叶表型的产生；系统进化树分析表明该基因编码的蛋白属于血红素加氧酶1亚家族,该基因的突变使蛋白的二级和三级结构发生了轻微改变,但是水稻原生质体亚细胞定位发现ygl2中该基因的突变并没有影响其编码蛋白在细胞叶绿体中的定位；GUS染色和qRT-PCR分析表明该基因在水稻各组织中组成型表达,但是在叶片中的表达量最高,并且苗期该基因的表达量高于分蘖期；不同温度处理后,YGL2基因的表达受到影响并且与叶绿素合成和光合作用相关的基因的表达均受到影响,表明YGL2在水稻叶绿素的合成和光合作用中具有重要的作用。YGL2的克隆为进一步阐明血红素加氧酶在调节植物叶绿素合成和光合作用中的重要作用奠定了基础。第二部分：水稻籽粒垩白的产生严重影响稻米品质,垩白是一个非常复杂的数量性状,精细定位和克隆控制垩白的QTL不仅有助于阐明水稻垩白形成的分子机制,同时还可以利用分子标记辅助选择的方法,提高育种效率。本研究中的C-51是一个以9311为轮回亲本,PA64S为供体亲本的染色体置换系材料,在不同环境下其垩白粒率均显著高于背景亲本9311,扫描电镜观察发现C-51垩白部分淀粉颗粒呈圆形或椭圆形,排列疏松,大小不一,而9311透明部分淀粉颗粒呈现多角形多面体状,棱角分明,淀粉粒相互嵌合紧密排列在一起,但是9311和C-51的灌浆速率和干物质积累无显著差异。本研究通过对前人研究结果的验证和进一步精细定位,最终将控制该垩白粒率的QTL qPGWC-7定位在第7染色体Indel18和Indel3两标记之间,区间大小约17.1kb。经过预测分析发现,该区间包含3个ORFs,其中C-51中ORF1的表达量在整个灌浆过程中均高于9311,在开花后第18天表达量达到最大,并且C-51和9311在氨基酸序列的保守结构域存在一个氨基酸的改变,因此将该ORF1作为候选基因进行功能分析。体外酶活测定证明在高垩白粒率的C-51中qPGWC-7的酶活与低垩白粒率的9311并没有明显差异,因此垩白粒率的差异可能和该基因的表达量差异有关；GUS组织化学染色检测则证明该基因主要在水稻各个组织中的维管组织中表达,在幼稳中表达量最高,并且该基因受低温诱导；拟南芥和水稻原生质体亚细胞定位将蛋白定位于细胞的高尔基体上。上述研究结果为qPGWC-7的进一步的功能研究奠定了良好的基础。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语
• 第一部分 水稻苗期黄绿叶基因YGL2的图位克隆和功能分析
• 第一章 文献综述
• 1 叶色突变体的类型及来源
• 1.1 叶色突变体的类型
• 1.2 叶色突变体的来源
• 1.2.1 自发突变
• 1.2.2 人工诱变
• 2 叶色突变的分子机制
• 2.1 叶绿素生物合成基因的突变
• 2.2 叶绿素合成的调控
• 2.3 叶绿素的降解
• 2.4 血红素至光敏色素生色团合成途径中基因突变
• 3 叶色突变体的应用价值
• 3.1 叶色突变体在植物生理研究中的应用
• 3.2 叶色突变体在生产实践中的应用
• 3.2.1 水稻叶色突变体作为标记性状应用于杂交育种
• 3.2.2 水稻叶色突变体在品种改良中的应用
• 4 本研究的目的和意义
• 第二章 水稻苗期黄绿叶基因YGL2的图位克隆和功能分析
• 摘要
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料和种植条件
• 1.2 野生型和突变体农艺性状的考察
• 1.3 叶绿素（Ch1）和类胡萝卜素（Car）含量的测定
• 1.4 透射电镜观察叶绿体结构
• 1.5 水稻叶片总DNA的提取（SDS小量提取法）
• 1.6 InDel引物的设计
• 1.7 PCR扩增反应
• 1.8 聚丙烯酰胺凝胶电泳和显色
• 1.9 候选基因的扩增和测序
• 1.10 载体的构建
• 1.10.1 过表达载体的构建
• 1.10.2 RNAi载体的构建
• 1.10.3 亚细胞定位载体的构建
• 1.10.4 启动子载体的构建
• 1.11 农杆菌的冻融法转化和水稻愈伤的侵染
• 1.12 水稻总RNA的提取及cDNA的合成
• 1.13 氨基酸同源性分析和系统树构建
• 1.14 水稻原生质体的制备和亚细胞定位
• 1.15 实时荧光定量RT-PCR
• 1.16 GUS组织化学染色
• 1.17 Ch1前体含量的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 不同时期野生型和ygl2突变体叶片观察和叶绿素含量测定
• 2.2 叶绿体超微结构的观察
• 2.3 ygl2突变体的遗传分析和基因的精细定位
• 2.4 定位区间内候选基因的确定和结构分析
• 2.5 YGL2的转基因验证
• 2.6 YGL2的系统树构建和同源性分析
• 2.7 YGL2和ygl2蛋白次级结构和三级结构的比较
• 2.8 YGL2-GFP和ygl2-GFP的亚细胞定位
• 2.9 YGL2基因的表达模式分析
• 2.10 野生型和ygl2突变体不同时期OsHO1和OsHO2的表达情况
• 2.11 YGL2表达受低温诱导并影响与叶绿素合成和光合作用相关基因的表达
• 2.12 光敏色素含量的测定和不同光处理下YGL2基因的表达
• 2.13 叶绿素合成中间产物的测定
• 3 讨论
• 第三章 小结
• 1 结论
• 1.1 ygl2突变体叶色黄化并且叶绿素含量下降
• 1.2 YGL2的突变影响了叶绿体类囊体结构的发育
• 1.3 ygl2基因被定位于66.8 kb的区间
• 1.4 YGL2的转基因互补和RNAi实验表明ORF6是目的基因
• 1.5 YGL2的突变导致蛋白二级和三级结构发生改变
• 1.6 YGL2被定位于细胞叶绿体上并且在植株中组成型表达
• 1.7 野生型和ygl2突变体不同时期OsHO1和OsHO2的表达情况
• 1.8 YGL2的表达受低温诱导并且影响与叶绿素合成和光合相关基因的表达
• 1.9 突变体光敏色素含量下降并且yg12基因对红光不敏感
• 1.10 突变体叶绿素合成中间产物含量发生改变
• 2 本研究创新之处
• 参考文献
• 第二部分 水稻垩白粒率QTL QPGWC-7的精细定位和候选基因的功能初步分析
• 第一章 文献综述
• 1 稻米垩白的评价指标和影响因素
• 1.1 稻米垩白的概念及测定方法
• 1.2 影响垩白形成的因素
• 1.2.1 蛋白对垩白形成的影响
• 1.2.2 灌浆时期光温条件对垩白形成的影响
• 1.2.3 栽培条件对垩白产生的影响
• 2 垩白形成的生理基础
• 2.1 稻米垩白形成的细胞学基础
• 2.2 稻米垩白形成与“源-库”关系
• 3 淀粉合成途径中的关键酶基因研究进展
• 3.1 ADP-葡萄糖焦磷酸化酶
• 3.2 颗粒结合状淀粉合成酶
• 3.3 可溶性淀粉合成酶
• 3.4 淀粉分支酶
• 3.5 淀粉去分支酶
• 4 垩白形成的分子遗传学基础
• 4.1 对垩白相关QTL的研究
• 4.2 对垩白突变体的研究
• 5 本研究的目的和意义
• 第二章 水稻垩白粒率QTL QPGWC-7的精细定位和候选基因的功能初步分析
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 田间试验和表型数据考察
• 1.3 成熟种子横断面扫描电镜观察
• 1.4 发育不同时期胚乳的取样
• 1.5 定位区间基因的预测及序列测定
• 1.6 琼脂糖凝胶回收
• 1.7 质粒的提取（小量提取法）
• 1.8 RNA的提取、cDNA的合成和实时荧光定量RT-PCR
• 1.9 qPGWC-7基因启动子载体构建及GUS组织化学染色
• 1.10 qPGWC-7的亚细胞定位
• 1.11 重组蛋白的原核表达和纯化
• 1.12 qPGWC-7酶活的测定
• 1.13 Western blot
• 2 结果与分析
• 2.1 9311与C-51白表型观察
• 2.2 开花后不同时期9311和C-51颖果鲜重和糙米干重的比较
• 2.3 QTL qPGWC-7的进一步精细定位
• 2.4 定位区间内基因的预测和分析
• 2.5 qPGWC-7基因结构分析
• 2.6 qPGWC-7在胚乳灌浆后的表达分析
• 2.7 qPGWC-7基因的组织表达模式
• 2.8 qPGWC-7基因的表达受低温诱导
• 2.9 qPGWC-7蛋白的原核表达与蛋白纯化
• 2.10 C-51和9311 qPGWC-7酶活的测定
• 2.11 qPGWC-7蛋白定位在高尔基体
• 2.12 qPGWC-7基因组互补载体、过表达载体和RNAi载体的构建和转化
• 3 讨论
• 第三章 小结
• 1 结论
• 1.1 在不同环境条件下C-51与9311垩白粒率存在显著差异
• 1.2 开花后不同时期9311和C-51颖果鲜重和糙米干重无显著差异
• 1.3 qPGWC-7最终被精细定位于17.1kb的区间内
• 1.4 候选基因氨基酸的改变和酶活测定
• 1.5 在灌浆过程中C-51qPGWC-7的表达水平始终高于9311
• 1.6 qPGWC-7基因是组成型表达并且受低温的诱导
• 1.7 qPGWC-7蛋白定位在高尔基体
• 2 本研究的创新之处
• 3 本研究中存在的问题
• 参考文献
• 附录
• 在读期间发表论文
• 致谢