电压依赖性钾通道和JNK信号转导通路在Aβ1-40诱导的神经细胞凋亡中的作用

论文摘要

AD是一种神经退行性疾病，主要影响65岁以上年龄的5-10％人口的记忆和认知功能，以老年斑形成、神经纤维缠结和神经元丢失为主要特征。老年斑形成的始动因素是Aβ淀粉样肽的沉积，后者被认为是AD病理机制的核心问题。Aβ具有神经元毒性作用，许多研究均已证实由Aβ诱发的神经元死亡涉及凋亡过程，而且在此方面的研究进步很大，如Aβ可诱发自由基的产生，钙离子平衡的紊乱，诱发tau蛋白磷酸化，进而导致微管结合能力的丧失等。大量研究表明，包括Aβ在内的许多损伤因素诱发的神经元死亡均伴随外向钾电流，尤其是延迟整流钾电流增大。同时JNK信号转导途径在阿尔茨海默病的发病过程中参与了早期老年斑（SP）的形成，造成弥散性Aβ沉积。而在Aβ大量沉积后，这一信号途径又参与了Aβ诱导的神经元凋亡过程。本研究观察并探讨了电压依赖性钾通道和JNK信号转导通路在Aβ1-40诱发的皮质神经元凋亡中的作用机制。本工作分为以下两大方面。第一部分钾通道在Aβ1-40诱导的神经元凋亡中的作用以MTT还原法和Hoechst33342染色法分别检测细胞的存活率和凋亡发生率。结果显示：Aβ1-405μM孵育12 h、24 h和48 h后，随着时间的延长，存活率逐渐降低。孵育48 h后可见部分神经元细胞核呈浓染的半月形或碎块状荧光。应用膜片钳技术观察Aβ1-40慢性孵育对皮质神经元IK和IA的影响。结果表明：Aβ1-40呈时间和剂量依赖性的增加IK。随着Aβ1-405μM孵育时间由6 h增加到48 h，IK逐渐增加，在48小时以内的各时间点，12小时达高峰。Aβ1-40引起的IK的增加对TEA 5 mM敏感。Aβ1-40慢性孵育12 h，浓度分别为2μM、5μM和10μM，延迟整流钾电流（IK）的电流密度分别增加了27.5％、42.3％和58.1％。另外，除了电流的幅值增加外，并不影响其外向整流特性。Aβ1-405μM孵育6-48 h后，瞬时外向钾电流并未发生明显的改变。不同浓度的Aβ1-40孵育12 h后，IA也未发生明显的变化。在Aβ1-40 5μM孵育前30min加入TEA 5 mM，与Aβ1-40一起共同孵育12h，24 h和48 h，应用MTT法和Hochest33342染色观察其对皮质神经元存活和凋亡的影响。结果表明：预先30 min加入TEA 5 mM可明显减轻Aβ1-40诱导的神经元死亡，使神经元的存活率明显升高，凋亡的发生率明显下降。应用比色法检测Aβ1-405μM慢性孵育不同时间后Caspase-3激活的改变。结果表明：Aβ1-40 5μM分别孵育12 h，24 h和48 h后，Caspase-3活性逐渐增加，在24 h达到高峰，与空白对照组相比较有显著性差异。所以我们选择24小时这个时间点检测TEA对Caspase-3激活的影响。结果表明，TEA 5 mM可减弱Aβ1-40诱发的Caspase-3的激活。应用western blot方法检测Bcl-2，Bax蛋白表达和细胞色素c的释放，与空白对照组比较，Aβ1-405μM慢性孵育24小时后可明显减少Bcl-2蛋白的表达，增加Bax蛋白的表达，Bax／Bcl-2比值上调，细胞色素c从线粒体释放入胞浆显著增加。在Aβ1-405μM孵育前30 min加入TEA 5 mM，与Aβ1-40一起共同孵育24 h。结果表明：TEA可显著的阻止Aβ1-40诱发上述凋亡相关蛋白发生改变。结论：Aβ1-405μM慢性孵育可诱导皮质神经元发生凋亡，并选择性上调皮质神经元的延迟整流钾电流。TEA 5 mM可明显减轻皮质神经元凋亡的发生。表明延迟整流钾通道的激活在Aβ1-40诱导神经元凋亡中发挥重要作用。TEA的神经元保护作用可能是通过影响这些凋亡相关蛋白而发挥作用的，同时表明钾通道的上调可能是先于这些事件发生的。第二部分JNK通路在Aβ1-40诱导的神经元凋亡和钾通道上调中的作用应用western blot法检测JNK的磷酸化。皮质神经元经Aβ1-405μM孵育0 h，1h，6h，12h，24h和48h后，JNK的磷酸化在不同时间点均有表达。随着孵育时间的延长，JNK磷酸化水平也逐渐增加，并于24h达到高峰。并且JNK的选择性阻断剂SP600125 10μM可明显的阻断这种激活。在Aβ1-405μM孵育前30 min加入SP600125 10μM，与Aβ1-40一起共同孵育12h，24h和48h，应用MTT法观察其对皮质神经元存活率的影响。结果表明：预先30 min加入SP600125 10μM可明显减轻Aβ1-40诱导的神经元死亡。同时凋亡的发生率也显著降低。应用比色法和western blot法观察JNK选择性阻断剂SP600125对Aβ1-40诱发的皮质神经元的Caspase-3，Bcl-2，Bax和细胞色素c释放的影响。结果表明：SP600125可显著的影响Aβ1-40诱发的上述凋亡相关蛋白的改变。应用全细胞膜片钳技术观察JNK选择性阻断剂SP600125对Aβ1-40诱发的延迟整流钾电流的影响。在Aβ1-405μM孵育前30 min加入SP600125 10μM，与Aβ1-40一起共同孵育6 h，12 h，24 h和48 h，发现延迟整流钾电流的激活发生了明显的改变，在大约前24小时，虽然IK的激活是逐渐增加的，但是与Aβ处理组相比，钾通道的激活被一定程度的抑制了，在12小时这个时间点，与Aβ的作用相比较差异具有显著性（p＜0.05）。然后随着时间的推移，钾电流的激活逐渐增加24小时以后保持一个较高的水平。在Aβ1-405μM孵育前30 min加入TEA 5 mM，与Aβ1-40一起共同孵育24 h，应用western blot法检测JNK的磷酸化。结果表明：在Aβ1-405μM孵育前30 min加入TEA5 mM，与Aβ1-40一起共同孵育24 h，JNK的磷酸化水平并未发生明显改变。结论：Aβ1-405μM慢性孵育可时间依赖性诱发皮质神经元JNK磷酸化，1小时即可使JNK磷酸化水平升高，且在24小时达高峰。JNK特异性阻断剂SP600125 10μM可保护Aβ1-405μM诱发的神经元死亡，提高神经元的生存率，降低凋亡的发生，对Aβ诱发的神经元毒性具有明显的保护作用。并且可能是通过影响Aβ诱发的凋亡相关蛋白的改变发挥其对神经元损伤的保护作用。由于TEA对Aβ1-40诱发的皮质神经元JNK磷酸化无显著影响。而钾通道的激活并未完全被SP600125抑制，24小时后钾通道激活仍然处于一个较高的水平。推测Aβ1-40引起的钾通道激活和JNK磷酸化通过不同的信号转导通路起作用，两者之间有一定的相互影响，但没有直接的因果关系，在诱导皮层神经元凋亡中可能具有一定的协同作用。

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• 1-40诱导的神经细胞凋亡中的作用'>研究论文:电压依赖性钾通道和JNK信号转导通路在Aβ_1-40诱导的神经细胞凋亡中的作用
• 1-40诱导的神经元凋亡中的作用'>第一部分 钾通道在Aβ_1-40诱导的神经元凋亡中的作用
• 前言
• 材料
• 方法
• 结果
• 1-40慢性孵育对皮质神经元存活率和凋亡的影响'>1.Aβ_1-40慢性孵育对皮质神经元存活率和凋亡的影响
• 1-40慢性孵育对皮质神经元延迟整流钾电流（I_K）和瞬间外向钾电流（I_A）的影响'>2.Aβ_1-40慢性孵育对皮质神经元延迟整流钾电流（I_K）和瞬间外向钾电流（I_A）的影响
• 1-40诱导的皮质神经元死亡的影响'>3.TEA对Aβ_1-40诱导的皮质神经元死亡的影响
• 1-40孵育不同时间后Caspase-3激活的变化'>4.Aβ_1-40孵育不同时间后Caspase-3激活的变化
• 1-40诱发的Caspase-3激活的影响'>5.TEA对Aβ_1-40诱发的Caspase-3激活的影响
• 1-40诱导的Bcl-2蛋白表达的影响'>6.TEA对Aβ_1-40诱导的Bcl-2蛋白表达的影响
• 1-40诱导的Bax蛋白表达的影响'>7.TEA对Aβ_1-40诱导的Bax蛋白表达的影响
• 1-40诱导的细胞色素c释放的影响'>8.TEA对Aβ_1-40诱导的细胞色素c释放的影响
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 1-40诱导的神经元凋亡和钾通道上调中的作用'>第二部分 JNK通路在Aβ_1-40诱导的神经元凋亡和钾通道上调中的作用
• 前言
• 材料
• 方法
• 结果
• 1-40孵育不同时间后皮质神经元JNK磷酸化的变化'>1.Aβ_1-40孵育不同时间后皮质神经元JNK磷酸化的变化
• 1-40诱导的皮质神经元死亡的影响'>2.SP600125对Aβ_1-40诱导的皮质神经元死亡的影响
• 1-40诱发的Caspase-3激活的影响'>3.SP600125对Aβ_1-40诱发的Caspase-3激活的影响
• 1-40诱导的Bcl-2蛋白表达的影响'>4.SP600125对Aβ_1-40诱导的Bcl-2蛋白表达的影响
• 1-40诱导的Bax蛋白表达的影响'>5.SP600125对Aβ_1-40诱导的Bax蛋白表达的影响
• 1-40诱导的细胞色素c释放的影响'>6.SP600125对Aβ_1-40诱导的细胞色素c释放的影响
• 1-40诱发的延迟整流钾电流增加的影响'>7.SP600125对Aβ_1-40诱发的延迟整流钾电流增加的影响
• 1-40诱发的皮质神经元JNK磷酸化的影响'>8.TEA对Aβ_1-40诱发的皮质神经元JNK磷酸化的影响
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 全文总结
• 综述:钾通道与凋亡发生
• 个人简历
• 在校期间完成论文情况
• 致谢