论文摘要
脑缺血可激活成年哺乳动物脑内的神经发生,诱导内源性神经前体细胞分裂、增殖并向损伤区域迁移,进而分化为成熟神经细胞,部分替代损伤后丢失的区域特异性神经元。脑缺血后神经发生的现象令人振奋,但增殖的神经前体细胞数量不足,且只有一小部分分化为神经元,所以并不能完全修复脑缺血后神经功能的缺损。因此,需要进一步研究缺血损伤后神经发生的机制及其调控因素,试图通过干预和/或增强内源性神经前体细胞的增殖、迁移、分化、整合,恢复损伤区域的正常神经元网络。Bcl-2是一种抗凋亡蛋白,在中枢神经系统发育与神经退行性疾病中发挥着重要作用。有证据显示Bcl-2除了抗缺血引起的神经元损伤,还具有抑制新生神经元的凋亡作用。令人注意的是,近来发现Bcl-2在神经元分化,轴突生长方面具有促进作用,该作用与其抗凋亡的作用不同。我室以往的研究结果已经表明给予Bcl-2质粒后,脑缺血后的梗塞灶体积明显缩小,提示过表达Bcl-2具有明显的脑保护效应。Bcl-2过表达增加同侧SVZ的面积,促进SVZ神经前体细胞的迁移。而且,Bcl-2促进神经前体细胞向缺血侧纹状体迁移,促进纹状体内神经元新生。Bcl-2过表达可增加纹状体迁移中的神经前体细胞（BrdU+-DCX+）数量;增加缺血纹状体内新生幼稚神经元（BrdU+-Tuj-1+）与成熟神经元（BrdU+-MAP-2+）数量;增加缺血纹状体新生GABA能(BrdU+-GAD67+)与胆碱能（BrdU+-ChAT+）神经元数量。在此模型基础上,通过采用短暂性大鼠大脑中动脉线栓（Middle cerebralartery occlusion,MCAO）模型结合Bcl-2表达质粒的侧脑室注射,利用免疫组织化学和分子生物学技术在脑缺血后1、3天或3、7、14天观察Bcl-2对BMP4、Noggin和β-catenin蛋白表达的影响,并在脑缺血后3、7、14和28天分析β-cateninsiRNA对Bcl-2促神经元新生作用的影响。我们进一步研究了Bcl-2促进成年大鼠缺血脑内神经元发生的具体分子机制。研究结果如下:1.Bcl-2对缺血缺血诱导的脑内BMP4、Noggin和β-catenin蛋白表达变化的影响1.1 BMP4、Noggin和β-catenin在脑缺血后缺血侧纹状体内的表达为评价BMP4、Noggin和β-catenin对脑缺血后纹状体内内源性神经发生的影响,我们首先分析了β-catenin蛋白在缺血侧纹状体内的表达。免疫组化结果发现,在正常纹状体内,β-catenin免疫活性主要定位于细胞膜和细胞质,β-catenin阳性细胞呈环状。β-catenin阳性细胞数和蛋白含量在缺血后3天缺血侧纹状体内均显著降低。BMP4和Noggin阳性细胞数和蛋白含量在缺血侧纹状体内明显增高并在3天达到顶峰。这些实验结果表明BMP4、Noggin、β-catenin可能在缺血诱导的纹状体内神经发生过程中发挥重要作用。1.2 Bcl-2过表达下调缺血侧纹状体内BMP4的表达,恢复缺血侧纹状体内β-catenin蛋白表达水平为观察Bcl-2过表达对缺血侧纹状体内BMP4、Noggin、β-catenin蛋白表达的影响,我们向缺血侧侧脑室注射Bcl-2表达质粒或对照质粒。Bcl-2过表达明显下调缺血侧纹状体内BMP4阳性细胞数量和蛋白含量。但Bcl-2过表达并不上调缺血侧纹状体内Noggin阳性细胞数和蛋白含量。而且,侧脑室给予Bcl-2质粒后可明显降低脑缺血3天后缺血侧纹状体内Noggin阳性细胞数量。与此同时,Bcl-2过表达在脑缺血后3天能恢复β-catenin阳性细胞数量和蛋白含量。这些结果表明Bcl-2过表达可能通过β-catenin来降低BMP4的表达。1.3 Bcl-2过表达对脑缺血后缺血侧纹状体内BMP7的表达无调节作用为排除Bcl-2过表达对BMPs家族中其它成员（如BMP7）的影响,我们观察了BMP7在脑缺血后缺血侧纹状体的表达。免疫组化结果显示BMP7免疫活性主要定位于神经元样细胞。免疫组化和Western blot结果表明BMP7阳性细胞和蛋白含量在缺血侧纹状体内明显增高并在3天达到顶峰。然而,缺血侧侧脑室注射Bcl-2表达质粒对缺血侧纹状体内BMP7的表达无明显调节作用。2.内源性β-catenin在Bcl-2促神经元新生中的作用及其机制分析2.1β-catenin siRNA取消Bcl-2过表达的神经保护效应为检测β-catenin siRNA对脑缺血后神经发生的作用,我们在缺血侧侧脑室注射Bcl-2表达质粒和/或β-catenin siRNA。结果显示侧脑室给予β-catenin siRNA可显著扩大脑缺血后3天的梗塞体积,抑制Bcl-2促SVZ神经干细胞增殖作用。提示β-catenin siRNA取消了Bcl-2脑保护效应。2.2β-catenin siRNA抑制Bcl-2促脑缺血后神经元新生的作用在脑缺血后3至28内,缺血侧纹状体内BrdU+-Tuj-1+、BrdU+-DCX+、BrdU+-MAP-2+细胞数量明显降低。有趣的是,BrdU+-GFAP+细胞数量在脑缺血后缺血侧纹状体内显著增加。而且,侧脑室给予β-catenin siRNA明显抑制缺血侧纹状体新生GABA能(BrdU+-GAD67+)与胆碱能（BrdU+-ChAT+）神经元数量。这些试验结果表明β-catenin siRNA抵消Bcl-2过表达的神经保护效应并抑制缺血侧纹状体内神经发生。抑制Bcl-2的作用后,β-catenin siRNA可以促使更多的神经前体细胞在缺血侧纹状体内分化为星形胶质细胞。2.3β-catenin siRNA抑制Bcl-2促脑缺血后神经元新生作用的机制为了检测BMP4和β-catenin相互作用关系,我们在缺血侧侧脑室注射Bcl-2表达质粒和/或β-catenin siRNA。β-catenin siRNA在脑缺血后3天缺血侧纹状体内显著抵消Bcl-2对BMP4下调作用并且同时明显降低β-catenin在缺血侧纹状体内的表达。这些实验结果表明β-catenin siRNA明显消除Bcl-2对缺血侧纹状体内BMP4下调作用。也就是说,Bcl-2过表达在缺血侧纹状体内通过β-catenin来降低BMP4的表达。结论:1.大鼠脑缺血后过表达Bcl-2促进缺血侧纹状体内神经元发生,并促进新生神经元分化成熟。2.Bcl-2可直接通过提高缺血侧纹状体内β-catenin的表达水平来降低BMP4的表达,从而促进脑缺血后纹状体内神经发生。3.内源性β-catenin对脑缺血后神经前体细胞的增殖、迁移和分化具有重要作用。