东海原甲藻基因表达特征研究

论文摘要

尽管东海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）的命名仍存在分歧,但它是我国特有的赤潮藻种,最近几年已在长江口和舟山群岛产生大规模的赤潮,造成了重大的经济损失和给生态带来了重大的影响,由此引起人们极大的关注。进年来,有关它的生活史,生态,分类,形态等研究很多,但其分子生物学研究却非常少。为了在东海原甲藻中开展相关的分子遗传学研究,我们构建了人工培养状态下的东海原甲藻对数生长期细胞的cDNA文库。从随机选取的700个克隆获得了565条可用的序列。本论文报道了从这些序列中鉴定的功能基因,尤其是那些与细胞程序化死亡相关的基因。另外,我们还对线粒体细胞色素b基因及细胞色素氧化酶亚基I基因进行了克隆与分析。在东海原甲藻的cDNA文库构建中,使用UNIQ-10 Trizol Total RNA Preparation Kit来进行总RNA的提取,将cDNA Synthesis Kit和PCR cDNA Library Kit组合使用进行cDNA的扩增,最后,将cDNA与pMD 18-T载体连接后转化到大肠杆菌JM109中。鉴定功能基因的一个比较恰当的途径是表达序列标签分析。实际上,这样的分析已经在许多真核生物中进行,被认为在某中程度上发挥与全基因组测序相同的作用。表达序列标签就是一段cDNA序列,能定义这些cDNA,但因为是单方向测序产物,不仅节约成本,也能获得与全长基因相似的信息。它们除了作为基因标签,也能用来比较转录物集合,做DNA芯片,尤其是鉴定功能基因。我们从东海原甲藻的cDNA文库中随机挑取克隆进行测序,得到565条EST这些序列可分为272个单一序列和36个重叠群（308个EST组）。在蛋白数据库中比较发现23组与已知功能蛋白相似的克隆,其中的大部分与能量代谢、转录/翻译及光合作用有关。有9组与甲藻中已知蛋白序列相匹配。另有14组与其它生物体中的已知蛋白序列相匹配。特别重要的是有两组EST分别与两个细胞程序化死亡的关键蛋白同缘,它们分别是半胱氨酰天冬氨酸特异蛋白酶（cysteine proteases）和分裂细胞

论文目录

• 1 文献综述
• 1.1 赤潮与有害赤潮
• 1.1.1 赤潮的危害
• 1.1.2 赤潮藻
• 1.1.3 东海原甲藻赤潮
• 1.2 甲藻简介
• 1.2.1 甲藻的分类
• 1.2.2 甲藻属于介核生物
• 1.2.3 甲藻兼而有之的动植物代谢途径
• 1.3 甲藻的分子遗传学研究进展
• 1.3.1 甲藻的表达序列标签分析
• 1.3.1.1 表达序列标签分析概述
• 1.3.1.2 其它藻类表达序列标签研究进展
• 1.3.1.3 甲藻表达序列标签研究进展
• 1.3.2 甲藻分子系统学研究进展
• 1.3.2.1 核糖体RNA 基因及 ITS
• 1.3.2.2 限制性片断长度多态性分析
• 1.3.2.3 线粒体基因组、质体基因组基因及其它基因作为分子标记
• 1.4 研究课题的提出及立项依据
• 1.4.1 东海原甲藻cDNA 文库的构建及EST 分析研究课题的提出
• 1.4.2 东海原甲藻系统学研究课题的提出
• 2 东海原甲藻cDNA 文库的构建
• 2.1 材料
• 2.1.1 藻种培养
• 2.1.2 藻类培养母液的配制
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 LB 培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 总 RNA 的提取及检测
• 2.2.1.1 提取 RNA 实验用品及相关处理
• 2.2.1.2 总 RNA 的提取
• 2.2.1.3 总 RNA 的纯化
• 2.2.1.4 总 RNA 的检测
• 2.2.2 cDNA 的合成
• 2.2.2.1 RNA 样品的预处理
• 2.2.2.2 cDNA 第一条链的合成
• 2.2.2.3 cDNA 第二条链的合成以及末端平滑化
• 2.2.2.4 双链cDNA 的精制
• 2.2.3 cDNA 的 PCR 扩增
• 2.2.3.1 与接头的连接
• 2.2.3.2 cDNA 的 PCR 扩增
• 2.2.3.3 cDNA 的回收
• 2.2.4 cDNA 文库的构建
• 2.2.4.1 与质粒载体的连接
• 2.2.4.2 电转化
• 2.2.4.3 文库的保存
• 2.2.5 重组子的筛选
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 总 RNA 的提取
• 2.3.2 cDNA 的合成与扩增
• 2.3.3 连接及重组子的筛选
• 2.4 小结
• 3 东海原甲藻的 EST 分析
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.2.1 EST 的测序
• 3.2.2 EST 数据处理
• 3.2.2.1 EST 分组
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 EST 序列的分析
• 3.3.1.1 EST 的分组
• 3.3.1.2 EST 数据的分析
• 3.3.2 几种重要的功能基因
• 3.3.2.1 主体蛋白
• 3.3.2.2 细胞核抗体蛋白
• 3.3.2.3 1，5，-二磷酸核酮糖激酶
• 3.3.3 Caspases 与浮游植物细胞程序化死亡
• 3.3.3.1 浮游植物存在细胞程序化死亡的证据
• 3.3.3.2 浮游植物基因组中的caspase 同源基因
• 3.3.3.3 东海原甲藻存在细胞程序化死亡过程
• 3.4 小结
• 4 东海原甲藻线粒体细胞色素b 基因的克隆与分析
• 4.1 材料
• 4.2 方法
• 4.2.1 DNA 的提取
• 4.2.2 限制性切割和cassette 的连接
• 4.2.2.1 DNA 的限制酶酶切反应
• 4.2.2.2 连接反应
• 4.2.3 东海原甲藻细胞色素b 基因的克隆
• 4.2.3.1 东海原甲藻细胞色素b 基因的PCR 扩增
• 4.2.3.2 切胶法回收PCR 扩增产物并纯化
• 4.2.3.3 PCR 扩增片断的克隆
• 4.2.4 克隆产物的测序与分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 DNA 的提取与酶切
• 4.3.2 东海原甲藻cob 基因的PCR 扩增和克隆
• 4.3.3 东海原甲藻cob 基因序列的组成及密码子的使用
• 4.3.4 东海原甲藻与其它甲藻的cob 基因碱基和氨基酸序列的比较
• 4.3.5 东海原甲藻与其它原甲藻cob 基因序列相比较碱基变异情况
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 5 东海原甲藻细胞色素氧化酶亚基 I 基因的克隆与分析
• 5.1 材料
• 5.2 方法
• 5.2.1 DNA 的提取
• 5.2.2 东海原甲藻细胞色素氧化酶亚基I 基因的克隆
• 5.2.2.1 东海原甲藻cox1 基因的PCR 扩增
• 5.2.2.2 切胶法回收PCR 扩增产物并纯化
• 5.2.2.3 PCR 扩增片断的克隆
• 5.2.3 克隆产物的测序与分析
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 东海原甲藻coxI 基因序列
• 5.3.2 东海原甲藻与其它甲藻coxI 基因的碱基和氨基酸序列的比较
• 5.3.3 东海原甲藻与其它原甲藻coxI 基因相比较碱基变异情况
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 6. 总结与创新点
• 6.1 总结
• 6.2 创新点
• 参考文献
• 在读期间发表和提交的论文
• 致谢