论文摘要
神经病理性疼痛（Neuropathic Pain, NP,简称神经痛）是由躯体感觉神经系统的损伤或相关疾病而造成的疼痛。神经痛是作为一类常见的慢性疼痛,与许多影响周围和中枢神经系统的疾病有关,如三叉神经痛、带状疱疹后神经痛（PHN）、糖尿病痛性神经病（DPN）、脑卒中后、帕金森病（PD）及多发性硬化（MS）等疾病。按国际上神经痛普通人群中的发病率约为8%推算,中国约有0.9亿神经痛患者。神经痛日益影响患者情绪及生活质量,严重则可致残疾,已成为公众关注的重要健康疾病。因此,深入探讨神经痛的发病与治疗机制,在临床与基础中均具有十分重要的意义。众所周知,各种慢性疼痛时,脊髓内都呈现出典型神经炎症现象,神经痛本身是神经纤维受卡压或劳损等引起,在神经压迫、损伤等引起的部分组织无菌性炎症过程中,随着伤害性信息的持续传入,脊髓胶质细胞增生活跃并释放炎性细胞因子,神经炎症（Neuroinflammation）现象十分明显,PGE2、ATP、NO等兴奋性物质也显著增加,痛觉传递神经元处于敏化状态,并促进中枢敏化形成和维持。目前,神经炎症的病理学概念已经广泛获得认可。研究证明,脊髓背角神经炎症的因素可导致痛觉过敏,而抑制胶质细胞增生为主的神经炎症,就可以产生镇痛效应。近年来的研究证实,脂氧素（Lipoxins, LXs）作为机体一类内源性的抗炎脂类介质,是来源于花生四烯酸、经脂氧合酶（Lipoxygenase, LO）催化合成的一类生物活性物质。在哺乳动物中,LXs主要包括脂氧素A4（LXA4）和脂氧素B4（LXB4）,因其在抗炎和促炎症消退中发挥重要的作用,而喻为炎症的“刹车信号”。脂氧素受体ALX作为一种细胞表面的G蛋白偶联受体,广泛存在于人体中性粒细胞、内皮细胞及中枢神经细胞中,LXs通过与ALX特异性结合发挥细胞生物学效应。研究表明,阿司匹林诱生型脂氧素（Aspirin-triggered LipoxinA4,ATL）作为LXs中一重要的类似物,在炎症痛中,通过与其相应的G蛋白偶联受体ALX结合而发挥抗炎镇痛作用,那么ATL是否在神经痛中发挥中枢调控作用,是否影响脊髓的炎症应答而减轻疼痛,这是本课题关注的一个问题。JAK2-STAT3作为细胞受体下游中的一重要信号通路,广泛参与细胞的生长、分化等过程,且本信号通路功能的“开闭”和SOCS系列分子负性调节密切相关。细胞因子信号抑制因子（suppressorsof cytokine signaling, SOCS）家族是一类可被多种细胞因子诱导产生,且对细胞因子信号通路具有负反馈调节作用的蛋白分子,参与多种细胞因子、生长因子和激素的信号调节。目前研究表明JAK2-STAT3广泛存在于中枢神经系统,且与神经痛（SNL模型）的发生发展相关,脊髓胶质细胞的激活有赖于JAK2-STAT3的磷酸化。因此,我们关注脊髓JAK2-STAT3是否也在CCI神经痛模型中参与作用,并调节脊髓炎性细胞因子的变化,而且主要探讨ATL是否通过JAK2-STAT3-SOCS信号通路,发挥中枢的抗炎镇痛作用,这是本课题关注的另一个核心问题。针灸作为祖国传统医学中一重要的治疗方法,在临床中常用于治疗各种神经痛,在基础研究中其抗炎镇痛作用亦比较明确。以往研究表明,AA相关代谢物和酶（前列腺素、COX-2、白细胞三烯等）在疼痛及电针抗炎镇痛中发挥重要作用,此外合成LXA4中的重要酶5-LO亦介导神经痛的发展。膜联蛋白（Annexins）是一类结构相关钙依赖的磷脂结合蛋白超家族,广泛存在于人类组织器官,其中膜联蛋白Al（AnnexinAl）作为糖皮质激素介导的抗炎反应的重要介质,通过与ALX结合,参与炎症及疼痛的调控过程。而电针是否通过脊髓5-LO、AnnexinAl调制神经痛觉过程,脊髓脂氧素受体ALX活动是否参与电针镇痛,是本课题要解决的第三个问题。综上所述,本论文拟在神经痛模型上,采用行为学、分子生物学等技术开展以下研究：（1）观察神经痛动物模型第7天,ATL对神经痛大鼠机械痛行为学和脊髓炎症因子的影响；（2）观察脊髓JAK2-pSTAT3在神经痛及ATL抗炎镇痛中的作用；（3）观察电针对神经痛行为学的影响,分析电针抗炎镇痛的分子机制。实验结果如下：第一部分脂氧素类似物ATL对神经痛大鼠机械痛及脊髓炎性细胞因子表达变化的影响1.神经痛大鼠的机械性痛觉超敏及热痛觉过敏行为学变化将大鼠随机分为3组,正常组（Normal）、假手术组（Sham）和模型组（Model）,每组8只。模型大鼠右侧大腿暴露坐骨神经,4-0铬制羊肠线结扎坐骨神经,假手术组只暴露坐骨神经而不结扎。从术后第2天开始,测量大鼠患侧后肢的机械性痛阈值（Paw Withdrawal Threshold, PWT）和热痛阈值（Paw Withdrawal Latency, PWL）,持续至造模后第21天。结果表明,神经痛大鼠与正常组、假手术组大鼠相比,患侧后肢机械性痛阈和热痛阈降低,出现明显的机械性痛觉超敏和热痛觉过敏现象。2.神经痛大鼠脊髓脂氧素受体ALX细胞定位及表达变化采用免疫荧光双标结合激光共聚焦方法,研究结果表明,与正常组、假手术组相比,模型组脊髓ALX免疫阳性细胞数量无显著差异；脊髓ALX免疫阳性物质大部分和星形胶质细胞共标,小部分与神经元共标,而与小胶质细胞不共标。Western-Blot实验结果表明,与正常组、假手术组相比,模型组中ALX表达无显著性差异。免疫荧光结合激光共聚焦方法、Western-Blot实验结果显示,模型组中脊髓背角星形胶质细胞增生明显。3.不同剂量ATL对神经痛大鼠机械痛行为变化的影响大鼠随机分为CCI+ATL组、CCI+NS组、CCI+BOC-2组、CCI+BOC-2+ATL组、Sham+ATL组,Sham组,每组6只。在神经痛大鼠术后7天,单次鞘内给予不同剂量ATL50ng、100ng、200ng,观察ATL在神经痛大鼠的中枢镇痛作用；尾静脉单次给药ATL 10ug/kg、40ug/kg,观察ATL的全身镇痛作用。实验结果显示,假手术组单纯鞘内给予ATL并未显著改变大鼠的机械痛阈；鞘内给予不同剂量ATL均可提高CCI大鼠的机械痛阈,以200ng剂量镇痛效果为最佳,ATL的中枢镇痛效应可被ALX拮抗剂BOC-2逆转,而CCI大鼠单纯鞘内给予BOC-2并未显著改变机械痛阈。尾静脉给药ATL （40ug/kg）亦可显著提高神经痛大鼠机械痛阈。4.ATL对神经痛大鼠脊髓炎性细胞因子表达变化的影响采用Real-Time PCR方法,观察单次鞘内给药ATL200ng对神经痛大鼠脊髓炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-a mRNA水平的影响。将实验大鼠随机分为正常组,假手术组,C CI+NS组, CCI+ATL组。RT-PCR结果显示,与正常组及假手术组相比,模型组中脊髓IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA均显著升高,单次鞘内给药ATL200ng 1h后可显著降低神经痛大鼠脊髓IL-1β、TNF-α mRNA的水平,鞘内给药ATL4h后可显著降低神经痛大鼠脊髓IL-6 mRNA的水平。小结：模型大鼠出现患侧后肢机械痛阈和热痛阈降低的现象,证实神经痛大鼠模型制备成功。ATL通过与脊髓背角星形胶质细胞表面受体ALX结合,降低模型大鼠的脊髓神经炎症反应,提高机械痛阈。ATL可通过全身作用途径,减轻机械性痛觉超敏。第二部分JAK2-STAT3在神经痛及ATL抗炎镇痛的作用1.ATL对神经痛大鼠脊髓p-STAT3及SOCS1-3表达变化的影响将大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、CCI+DMSO组, CCI+ATL组,术后第7天取材行Vestern-Blot、Real-Time PCR和免疫荧光结合激光共聚焦实验方法。结果显示,与正常组和假手术组相比,神经痛模型大鼠脊髓p-STAT3表达显著上调,SOCS2 mRNA、SOCS3 mRNA表达显著升高。与CCI+DMSO组相比,鞘内给予ATL200ng 1h后可进一步显著上调SOCS3 mRNA的表达,对SOCS1 mRNA、SOCS2 mRNA的表达无显著影响；ATL在给药4h后显著下调脊髓p-STAT3的表达。2. JAK2-STAT3信号通路在大鼠神经痛中的作用2.1 JAK2抑制剂AG490对神经痛大鼠机械痛行为变化的影响大鼠随机分为正常组,CCI+DMSO组,CCI+AG490-lug组,CCI+AG490-5ug组,每组10只。AG490组在造模前2小时及造模后第1天,第2天分别给予鞘内注射lug,5ug AG490,共鞘内注射3次,并于造模后第2天,第4天,第7天观察机械痛行为的变化。结果显示,与CCI+DMSO组相比,鞘内给予AG490-1ug、5ug均可提高神经痛大鼠的机械痛阈,在术后第7天,AG490-5ug提高痛阈效果优于AG490-1ug。2.2 AG490对神经痛大鼠脊髓炎性细胞因子表达变化的影响实验大鼠分为正常组,CCI+DMSO组, CCI+AG490-5ug组,AG490组在造模前2小时及造模后第1天,第2天给予鞘内注射5ug AG490,共鞘内注射3次,并于造模后第7天新鲜取材检测脊髓炎性细胞因子的表达变化。Real-Time PCR实验结果表明,与CCI+DMSO组比较,鞘内注射AG490-5ug可显著降低脊髓IL-1β、IL-6和TNF-a mRNA的水平。2.3 AG490对神经痛大鼠的脊髓SOCS表达变化的影响大鼠分为正常组,CCI+DMSO组,CCI+AG490-5ug组,AG490组在造模前2小时及造模后第1天,第2天给予鞘内注射5ug AG490,共鞘内注射3次,并于造模后第7天新鲜取材检测脊髓SOCS的表达变化。Real-Time PCR实验结果表明,与CCI+DMSO组比较,鞘内注射AG490-5ugAG490可显著提高脊髓SOCS1mRNA和SOCS3 mRNA的水平,而对SOCS2 mRNA水平无显著影响。小结：脊髓JAK2-STAT3-SOCS信号通路参与神经痛的发生发展,ATL可通过调节脊髓p-STAT3表达变化而发挥抗炎镇痛作用。第三部分电针对神经痛大鼠抗炎镇痛的脊髓分子机制1.电针对不同时程神经痛大鼠的行为学及分子机制1.1电针对不同时程神经痛大鼠的机械痛及热痛行为学的影响大鼠随机分为CCI组,CCI+EA组和CCI+SEA组,每组6只。采用Von-Frey hairs（弗莱毛测痛法）和热辐射测痛仪,检测神经痛大鼠患侧（右侧）足底机械痛阈（PWT）和热痛阈（PWL）变化。将实验大鼠按神经痛不同时程（术后3、7、21日,即POD3、POD7、POD21）分为3批进行电针干预实验。在造模后第3天,与CCI组相比,EA组在电针结束后60min、90min可显著提高机械痛阀值（*P<0.05）,与SEA组相比,EA组在电针结束后60min可显著提高机械痛阈值：与CCI、SEA组相比,EA组在电针结束后30min、45min、 60min可显著提高患侧热痛阈值（*P<0.05,**P<0.01）。在造模后第7天,EA组在电针结束后30min、45min、60min可显著提高机械痛和热痛阂值（*P<0.05,**P<0.01）。在造模后第21天, EA组在电针结束后45min、60min可显著提高机械痛和热痛阈值（*P<0.05,**P<0.01）。研究结果提示,单次电针30min对不同时程（POD3、POD7、POD 21）神经痛大鼠的痛行为（热痛、机械痛）均有明显改善作用,可在电针后30min、45min、 60 min、90min不同时间点发挥镇痛作用,其中在改善机械痛、热痛行为学方面,以电针后60min较为显著。1.2电针对不同时程神经痛大鼠脊髓5-LO及Annexin A1的影响采用Real-Time PCR方法,检测单次电针对不同时程神经痛大鼠脊髓5-LOmRNA和nnexinA1 mRNA水平变化的影响。研究结果显示,在术后第3天,单次电针可提高神经痛大鼠的脊髓5-LOmRNA水平（**P<0.01）,而对AnnexinA1 mRNA变化不影响；在术后第7天,单次电针可提高AnnexinAl mRNA水平,而对5-LO mRNA不影响；在术后第21天,单次电针均可提高AnnexinAl mRNA和5-LO mRNA水平。2.神经痛大鼠脊髓脂氧素受体ALX在电针镇痛中的作用2.1 ALX拮抗剂BOC-2对电针镇痛时机械痛行为变化的影响将大鼠随机分为CCI组、CCI+Sham-EA组,CCI+EA组,CCI+EA+BOC-2组,观察电针及鞘内注射BOC-2对神经痛大鼠机械痛行为的影响。与假电针组相比,神经痛大鼠经单次电针或多次电针干预后,均可显著提高机械痛阈,而电针的即刻和累积镇痛效应均可被单次或多次鞘内注射的BOC-2逆转,而神经痛大鼠单纯鞘内注射BOC-2并未影响机械痛阈。2.2 BOC-2对电针镇痛时脊髓炎性细胞因子表达变化的影响将大鼠随机分为CCI组、CCI+MEA组和CCI+MEA+BOC-2组,观察多次电针及鞘内注射BOC-2对神经痛大鼠脊髓炎性细胞因子表达的影响。与模型组相比,多次电针可显著降低神经痛大鼠脊髓IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的水平,而脊髓鞘内注射BOC-2可逆转多次电针的抗神经炎症效果。小结：电针可能通过上调5-LO mRNA 和 AnnexinA1 mRNA表达,增加神经痛大鼠体内ALX配体物质的生成,部分通过ALX信号通路,下调脊髓炎性细胞因子表达,提高神经痛大鼠的机械痛阈。综上所述,本工作提示：1.脂氧素受体ALX主要表达于脊髓背角星形胶质细胞。脂氧素类似物ATL与细胞表面受体ALX特异性结合,抑制脊髓的神经炎症过程,减轻神经痛大鼠的机械痛觉超敏。ATL在静脉给药后也发挥全身抗炎镇痛的作用。2.在神经痛过程中,脊髓p-STAT3, SOCS2 mRNA, SOCS3 mRNA表达上调,抑制JAK2可减轻神经痛大鼠的机械性痛觉超敏,缓解脊髓的神经炎症反应,鞘内注射ATL可降低p-STAT3表达,提高SOCS3 mRNA表达,提示脊髓JAK2-STAT3-SOCS3信号通路参与神经痛的过程。3.电针可提高神经痛大鼠的机械痛阈和热痛阈,并提高脊髓5-LO和AnnexinAl mRNA水平的表达,鞘内注射BOC-2可拮抗电针的镇痛作用,以上结果提示,电针可能通过提高神经痛大鼠体内ALX配体物质含量,与ALX特异性结合后,降低脊髓炎性细胞因子的表达,发挥抗炎镇痛的作用。