三角帆蚌3个免疫基因的克隆、分子特征分析及SNP的应用研究

论文摘要

三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）是我国最重要的淡水育珠蚌。随着近年来三角帆蚌养殖病害不断爆发,深入开展三角帆蚌功能基因的研究,尤其是免疫相关基因及其机制的研究并在此基础上寻找三角帆蚌疾病防治的有效方法对三角帆蚌的健康养殖十分重要。本论文根据构建的三角帆蚌cDNA文库中已标注的EST序列,利用cDNA末端快速扩增法（RACE）克隆了三角帆蚌谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase, GPX）基因、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）基因和干扰素调节因子2（interferon regulatory factor 2, IRF-2）基因的全长cDNA序列,对这3个基因的cDNA序列和氨基酸序列进行了分析;并通过PCR和基因组步移法,从三角帆蚌DNA中扩增出这些基因的部分基因组DNA序列和5′调控区。同时,通过直接测序法在两个三角帆蚌群体（抗性群体和易感群体）中筛选这3个基因的SNP（single nucleotide polymorphism）位点,并对SNP位点的基因型和等位基因频率在各群体中的遗传分布进行研究,以获得与抗性性状相关的SNPs位点,为三角帆蚌遗传育种研究提供新的分子标记。主要研究结果如下:1.三角帆蚌3个免疫基因cDNA全序列的克隆及分子特征三角帆蚌GPX基因cDNA序列全长1286bp,包括5′端非翻译区（Untranslated Region） 39bp、3′端非翻译区659bp和开放阅读框（Open reading frame,ORF）588bp,共编码195个氨基酸,分子量约为22.2 KDa,理论等电点为8.44,属于含硒类GPX。该氨基酸序列具有GPX所有亚型中均高度保守的3个环状结构,对酶的三级结构起稳定作用。氨基酸相似性对比结果显示,三角帆蚌GPX氨基酸序列与脊椎动物GPX-2及GPX-1的序列相似度较高,为73.1%-80.8%。三角帆蚌SOD基因cDNA序列全长763 bp,包括5′端非翻译区62bp、3′端非翻译区74 bp和开放阅读框627bp,共编码208个氨基酸,分子量约为22.8 kDa,理论等电点为8.25,并预测N-末端疏水区包含由22个氨基酸组成的信号肽。该氨基酸序列存在两个CuZnSOD的签名序列;另外Cu结合位点必须氨基酸（His-93,-95,-110和-169）和Zn结合位点必须氨基酸（His-110,-118,-129和Asp-132）在CuZnSOD中保守。构建的系统进化树显示三角帆蚌CuZnSOD与胞外CuZnSOD聚为一类,与已发表的淡水贝类褶纹冠蚌（Cristaria plicata）的胞内CuZnSOD相距较远。推测本实验克隆得到的三角帆蚌CuZnSOD基因属于胞外CuZnSOD类型。三角帆蚌IRF-2基因cDNA序列全长2688 bp,包括5′端非翻译区110bp、3′端非翻译区1588 bp和开放阅读框990bp,共编码329个氨基酸,分子量约为37.6 kDa,理论等电点为5.1。该氨基酸序列具有高度保守的N端DBD结构域,并且包含6个重复色氨酸。氨基酸同源对比结果显示,三角帆蚌IRF-2氨基酸序列与哺乳动物、鸟类、两栖类和鱼类的IRF-2序列同源性较低,为24.3%-32.6%,序列N端的DBD区域的同源性较高,为56.6%-62.8%,而C端的序列同源性更低,仅为9.4%-23.1%。2.三角帆蚌3个免疫基因的基因序列及5′调控区通过PCR和基因组步移法,从三角帆蚌DNA中扩增出GPX基因及其5′调控区、IRF-2基因部分序列及其5′调控区、SOD基因部分序列。GPX基因序列全长6708 bp,含有2个外显子,1个内含子。5′调控区992 bp,外显子Ⅰ273 bp,外显子Ⅱ991 bp,内含子Ⅰ长度为4491 bp。5′调控区含有启动子的核心序列TATA盒以及其他一些转录调控元件,如AP1、C/EBP、CdxA。SOD基因部分序列含有三个内含子,内含子Ⅱ长1533bp,内含子Ⅲ长3973 bp,内含子Ⅳ长2912bp。扩增的IRF-2基因内含子Ⅰ长度为465bp,5′调控区1669 bp,5′调控区含多个转录调控元件,如AP1、CdxA、HSF、NIT2以及HNF-3b。3.三角帆蚌抗性群体和易感群体的SNP分析以三角帆蚌鄱阳湖野生群体（抗性群体）和金华养殖群体（易感群体）为研究对象,通过直接测序法筛选SNPs位点。在GPX基因中共获得了21个SNP位点,并研究这些多态性位点与抗逆性状的相关性。其中启动子区的-894G-A位点、-907A-C位点、-944A-C位点,内含子区的-3833T-A位点、-3839C-T位点、-4138G-C位点、-4142A-G位点以及-5637G-T位点的基因型频率和等位基因频率在抗性和易感群体中均存在显著性差异（P<0.05）。在SOD基因中筛选出18个SNP位点,其中-7994C-G、-8087G-C位点的基因型频率和等位基因频率在2个群体中均存在显著性差异（P<0.05）,-7994C-G位点C/G基因型特异存在于抗性群体中,-8087G-C位点G/C基因型特异存在于易感群体中。-8001A-G位点、-8035G-A位点、-8191T-A位点基因型频率在2个群体中存在显著性差异（P<0.05）。在IRF-2基因中共筛选出12个SNP位点,其中-1918C-T位点、-3786G-T位点等位基因频率在2个群体中存在显著性差异（P<0.05）,-3917T-C位点基因型频率在2个群体中存在显著性差异（P<0.05）,-4034C-T位点的基因型频率和等位基因频率在2个群体中均存在显著性差异（P<0.05）。-3917T-C位点C/C基因型特异性存在于抗性群体中,-4034C-T位点T/T基因型特异性存在于抗性群体中。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1 贝类免疫系统
• 2 贝类部分免疫相关基因
• 2.1 谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GPX）基因
• 2.2 超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）基因
• 2.3 干扰素调节因子2（interferon regulatory factor 2, IRF-2）基因
• 3 单核苷酸多态性及其应用
• 3.1 单核苷酸多态性
• 3.2 单核苷酸多态性的应用
• 4 研究的内容和意义
• 4.1 研究内容
• 4.2 研究意义
• 第二章 三角帆蚌3 个免疫基因CDNA 的克隆和分析
• 第一节 三角帆蚌GPX 基因CDNA 的克隆和分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 PCR 扩增与克隆测序
• 2.2 三角帆蚌GPX 基因cDNA 序列的特征分析
• 2.3 三角帆蚌GPX 氨基酸序列分析
• 2.4 GPX 蛋白的结构预测分析
• 2.5 三角帆蚌GPX 氨基酸序列同源性及分子进化分析
• 3 讨论
• 第二节 三角帆蚌SOD 基因CDNA 的克隆和分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 PCR 扩增与克隆测序
• 2.2 三角帆蚌SOD 基因cDNA 序列的特征分析
• 2.3 三角帆蚌SOD 氨基酸序列分析
• 2.4 SOD 蛋白的结构预测分析
• 2.5 三角帆蚌SOD 氨基酸序列同源性及分子进化分析
• 3 讨论
• 第三节 三角帆蚌IRF-2 基因CDNA 的克隆和分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 PCR 扩增与克隆测序
• 2.2 三角帆蚌IRF-2 基因cDNA 序列的特征分析
• 2.3 三角帆蚌IRF-2 氨基酸序列分析
• 2.4 IRF-2 蛋白的结构预测分析
• 2.5 三角帆蚌IRF-2 氨基酸序列同源性及分子进化分析
• 3 讨论
• 第三章 三角帆蚌3 个免疫基因的基因组结构和启动子分析
• 第一节 三角帆蚌GPX 基因结构和启动子分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 实验方法
• 2 结果与讨论
• 2.1 PCR 扩增结果
• 2.2 GPX 基因序列分析
• 第二节 三角帆蚌SOD 基因结构分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 实验方法
• 2 结果与讨论
• 2.1 PCR 扩增结果
• 2.2 SOD 基因序列分析
• 第三节 三角帆蚌IRF-2 基因结构和启动子分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 实验方法
• 2 结果与讨论
• 2.1 PCR 扩增结果
• 2.2 IRF-2 基因序列分析
• 第四章 三角帆蚌抗性群体和易感群体的SNP 分析
• 第一节 三角帆蚌GPX 基因SNP 多态性与抗性分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 GPX 基因多态位点的筛选
• 2.2 GPX 基因SNP 及相关性分析
• 3 讨论
• 第二节 三角帆蚌SOD 基因SNP 多态性与抗性分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 SOD 基因多态位点的筛选
• 2.2 SOD 基因SNP 及相关性分析
• 3 讨论
• 第三节 三角帆蚌IRF-2 基因SNP 多态性与抗性分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 IRF-2 基因多态位点的筛选
• 2.2 IRF-2 基因SNP 及相关性分析
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 硕士在读期间发表论文
• 致谢