论文摘要
目的:目前我国诊断的前列腺癌患者仍以晚期患者为主,而对于晚期患者,治疗方式仍以内分泌治疗为主。在任何内分泌治疗过程中,前列腺癌都不可避免地发展为激素难治性前列腺癌。而激素难治性前列腺癌的治疗是目前前列腺癌治疗中的重点与难点。虽然各种治疗方法层出不穷,从化疗到放疗,从生物治疗到同位素治疗,但真正能延长生存的治疗方法并不多。肿瘤免疫学认为:肿瘤的发生发展与肿瘤逃逸密切相关,而在肿瘤逃逸的因素中,肿瘤细胞自身分泌的免疫抑制因子具有重要作用。其中TGF-β是肿瘤细胞分泌的已知的最强的免疫抑制因子。我们通过用携带显性负相的TGF-βⅡ型受体基因的慢病毒载体感染人CTL,使其对TGF-β不敏感,然后研究对TGF-β失敏感的肿瘤特异性CTL在前列腺癌治疗中的作用和意义,为晚期前列腺癌的治疗探索一条新的治疗途径。方法:分三个步骤进行:首先,在已有的pMIG-TβRIIDN（MSCV-RIIDN-IRESGFP）和pAdTrack-CMV-TK质粒的基础上制备感染效率高的慢病毒载体,此载体携带显性负相的TGF-βⅡ型受体（dominant negative TGF-beta typeⅡreceptor）和HSV-tk（herpes simplex virus thymidine kinase）融合基因,HSV-tk基因主要用于去除多余的淋巴细胞。其次,前列腺根治性切除术时采集新鲜前列腺癌组织标本,分为两部分,一部分储存于组织库,另一部分立即剪成1～2mm的小块,用基底膜基质（Matrigel Basement Membrane Matrix）进行包埋,1天后种植于4周龄雄性裸鼠前侧躯干皮下。待皮下包块长到1.5cm大小时,取出肿瘤组织块,再进行裸鼠传代。当第三代前列腺癌异种移植模型的皮下组织块长到1.5cm时采集与组织来源同一患者的外周血20ml,然后进行单核细胞体外分离,当天将DC与CTL分开培养。5天后用肿瘤抗原粗提物刺激体外培养的DC细胞,48小时后将DC和CTL细胞混合培养,使CTL具有肿瘤特异性。第三,用慢病毒将显性负的TβRⅡDNglytk基因导入到肿瘤特异性的CTL细胞,获得对TGF-β不敏感的同源的肿瘤特异性CTL细胞。第四,以表达TRANSglytk蛋白的CTL作对照,验证所制备的对TGF-β不敏感的肿瘤特异性的CTL细胞对肿瘤异种移植裸鼠模型所负载的前列腺癌的治疗作用。结果:1、运用重组PCR技术合成了TβRⅡDNglytk及TRANSglytk基因,将此基因用Invitrogen公司的TOPO技术连接到pLenti6/V5-D-TOPO（?）载体,构建成功了慢病毒表达载体,并经过测序验证;并制备了含有TβRⅡDNglytk及TRANSglytk基因的慢病毒液,病毒滴度分别达到了5.85×106和6.2×106。2、前列腺癌肿瘤蛋白粗提物能有效刺激DC,进而使CTL细胞具有肿瘤抗原特异性;肿瘤特异性的CTL显示了与非肿瘤特异性CTL不同的特点;携带TβRⅡDNglytk或TRANSglytk基因的慢病毒可以有效转染肿瘤特异性CTL;经Western blot鉴定,表达TβRⅡDNglytk蛋白的CTL对TGF-β反应不敏感,而表达TRANSglytk蛋白的CTL却在TGF-β刺激下出现较强的TGF-β下游蛋白P-Smad2/3的表达;表达TβRⅡDNglytk或TRANSglytk蛋白的CTL能被GCV杀灭,提示转入的HSV-tk基因是有效的,运用此系统可以作为杀灭多余CTL的工具。3、用裸鼠成功建立前列腺癌异种移植模型,用体外过继培养得到的对TGF-β不敏感的肿瘤特异性CTL能显著抑制同一个体来源的裸鼠异种移植模型所负载的前列腺癌组织的生长。结论:裸鼠异种移植模型的制备为前列腺癌免疫治疗的体内及体外研究提供良好的实验条件;在体外过继培养中,通过对肿瘤特异性的CTL进行修饰改造,使其对TGF-β失敏感,用这种对TGF-β不敏感的肿瘤特异性CTL作用于裸鼠前列腺癌异种移植模型,可以显著抑制肿瘤的生长。显示了此方法在晚期前列腺癌患者的治疗中可用于前列腺癌的个体化免疫治疗,具有一定的应用前景。
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标签：慢病毒载体论文; 前列腺癌论文; 免疫治疗论文; 裸鼠异种移植模型论文;