家蚕表达霍乱毒素B亚基与人胰岛素或胰岛素B链融合蛋白及其抗自身免疫性糖尿病的研究

论文摘要

Ⅰ型糖尿病由胰岛素分泌缺陷产生,它是一种针对胰岛β细胞的自身免疫性疫病。在疾病发展过程中,胰岛素及其前体、谷氨酸脱羧酶(GAD)、热休克蛋白(HSP60)等多种自身抗原被T细胞识别,产生自身免疫反应并导致胰岛损伤。动物实验表明通过口服一种自身抗原,如胰岛素或GAD,即诱导了免疫耐受,产生了保护作用,进而抑制糖尿病的发生。 1.口服家蚕表达CTB与胰岛素融合蛋白对治疗自身免疫性糖尿病的研究口服疾病特异性自身抗原能诱导口服免疫耐受,并能有效延缓或抑制自身免疫性疾病症状的发生。在体内成功诱导免疫耐受需要长期口服大量的蛋白抗原,霍乱毒素B亚基(CTB)可作为诱导口服耐受的强大粘膜运载系统,自身抗原通过与CTB蛋白偶联可极大地较少口服自身抗原的剂量。这些都暗示CTB偶联自身抗原不仅使口服耐受防治Ⅰ型糖尿病等自身免疫性疫病更具有实际应用价值,而且还有潜在的治疗前景。在本研究中我们构建了CTB与人胰岛素融合基因,并在家蚕中得到高效表达,融合蛋白(20kDa)在家蚕幼虫的蚕血淋巴中表达量达到0.3mg/ml。经检测,该融合蛋白在家蚕中以五聚体形式存在,并且保持GM1神经节苷脂的受体结合特性以及CTB和胰岛素的抗原性。非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠经口服含微克级的CTB与胰岛素融合蛋白的蚕血淋巴,病理组织切片实验表明胰岛发炎程度显著减轻。适时监测血糖的实验结果亦表明糖尿病的病理症状得到明显延缓,过继转移实验亦表明口服该融合蛋白产生了潜在的调节性T细胞从而抑制糖尿病的发生。这些结果表明家蚕生物反应器是一个合适的生产口服疫苗系统,并通过该系统诱导针对T细胞介导的自身免疫疾病的免疫耐受,该研究是利用我国自身蚕业资源优势研制抗Ⅰ型糖尿病口服疫苗,为Ⅰ型糖尿病的治疗开辟了新的途径。 2.部分多角体同源序列对外源基因在杆状病毒表达系统中表达的影响分析目前家蚕杆状病毒表达载体系统(BEVS)已被广泛用来高效表达外源基因,

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ABSTRACT

第一章文献综述

1.1 Ⅰ型糖尿病（IDDM）的自身免疫

1.1.1 T淋巴细胞与IDDM

1.1.2 细胞因子水平异常

1.2 IDDM的口服耐受治疗

1.2.1 口服自身抗原

1.2.2 影响口服耐受效果的因素

1.3 口服耐受治疗的免疫机制

1.3.1 活性抑制机制

1.3.2 细胞无反应机制

1.3.3 细胞灭亡机制

1.4 霍乱毒素B亚基（CTB）粘膜载体系统

1.4.1 CTB作为载体蛋白的研究

1.4.2 CTB的融合表达研究

1.5 家蚕／BMNPV表达系统

1.5.1 家蚕／BmNPV表达系统的特点

1.5.2 影响外源基因表达量的因素

第二章实验方案设计

2.1 实验目的和意义

2.2 研究内容

2.2.1 口服家蚕表达的CTB与胰岛素融合蛋白对治疗Ⅰ型糖尿病的研究

2.2.2 部分多角体同源序列对外源基因在家蚕—杆状病毒表达系统中表达的影响

2.2.3 口服家蚕表达CTB与胰岛素B链融合蛋白对治疗Ⅰ型糖尿病的研究

2.3 技术路线与实验方案

第三章口服家蚕表达CTB与胰岛素融合蛋白对治疗自身免疫性糖尿病的研究

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 实验材料和试剂

3.2.2 人胰岛素基因（INS）的构建

3.2.3 含有CTB与人胰岛素融合基因（CTB-INS）的重组转移载体的构建

3.2.4 重组杆状病毒（BmNPV-CTB-INS）的筛选

3.2.5 重组蛋白在家蚕细胞和幼虫中的表达

3.2.6 重组蛋白表达量的测定与GM1结合力检测

3.2.7 表达产物的Western印迹

3.2.8 口服耐受在NOD小鼠中的诱导

3.2.9 小鼠血清抗CTB与抗胰岛素抗体水平的检测

3.2.10 小鼠胰腺病理组织切片分析

3.2.11 过继转移实验

3.2.12 血糖水平检测与评价

3.3 结果分析

3.3.1 人胰岛素基因的克隆与鉴定

3.3.2 重组转移载体pBacPAK-CTB-INS的构建与鉴定

3.3.3 重组杆状病毒BmNPV-CTB-INS的构建与鉴定

3.3.4 重组融合蛋白在家蚕中的高效表达

3.3.5 重组融合蛋白的免疫印迹与受体结合能力分析

3.3.6 口服CTB-INS融合蛋白在NOD小鼠中诱导体液免疫反应的分析

3.3.7 口服融合蛋白抑制NOD小鼠胰岛炎的发生

3.3.8 口服融合蛋白治疗NOD小鼠糖尿病的发生

3.3.9 口服融合蛋白诱导NOD小鼠产生调节性T细胞

3.4 讨论

第四章部分多角体同源序列对外源基因在杆状病毒表达系统中表达的影响分析

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 实验材料和试剂

4.2.2 重组转移载体pBacPAK-mCTB-INS的构建

4.2.3 重组杆状病毒（BmNPV-mCTB-INS）的筛选

4.2.4 重组蛋白在家蚕细胞和幼虫中的表达

4.2.5 重组蛋白表达量的测定

4.2.6 表达产物的Western印迹

4.2.7 重组蛋白的GM1结合力检测

4.3 结果分析

4.3.1 重组转移载体pBacPAK-mCTB-INS的构建与鉴定

4.3.2 重组杆状病毒BmNPV-mCTB-INS的筛选与鉴定

4.3.3 融合的部分多角体同源序列（PPHS）增强了mCTB-INS在家蚕中的表达

4.3.4 融合蛋白的Western blot和受体结合能力分析

4.4 讨论

第五章口服家蚕表达CTB与胰岛素B链融合蛋白对治疗糖尿病的研究

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.2.1 实验材料和试剂

5.2.2 重组转移载体pBacPAK-CTB-InsB的构建

5.2.3 重组杆状病毒（BmNPV-CTB-InsB）的筛选

5.2.4 重组蛋白在家蚕细胞和幼虫中的表达

5.2.5 重组蛋白表达量的测定与GM1结合力检测

5.2.6 表达产物的Western印迹

5.2.7 口服耐受在NOD小鼠中的诱导

5.2.8 小鼠胰腺病理组织切片分析

5.2.9 血糖水平检测与评价

5.3 结果分析

5.3.1 重组转移载体pBacPAK-CTB-InsB的构建与鉴定

5.3.2 重组杆状病毒BmNPV-CTB-InsB的筛选与鉴定

5.3.3 重组蛋白在家蚕中的高效表达

5.3.4 重组蛋白的Western blot和受体结合能力分析

5.3.5 口服重组蛋白对NOD小鼠胰岛炎的抑制作用

5.3.6 口服融合蛋白延缓NOD小鼠糖尿病的发生

5.4 讨论

研究的创新点及展望

参考文献

攻读博士学位期间发表（或已投稿）的学术论文及，申请的专利

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