荧光素酶作为报告基因的丙型肝炎病毒细胞感染系统的建立和应用

论文摘要

丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus, HCV）是丙型肝炎这一重要传染病的病原体。据报道,目前全世界约有一亿七千万人感染HCV,其中约80%的感染者发展为慢性肝炎,而在十到二十年的慢性病程中,又有部分患者进展成肝硬化,肝细胞肝癌。实际上,丙型肝炎病毒感染已经成为严重危害人类健康的全球性公共卫生问题。但迄今相应的疫苗还未问世,针对该病毒的预防措施和治疗策略也十分有限。目前抗HCV的标准治疗方案是聚乙二醇干扰素加利巴韦林的联合疗法,用药者中持续病毒学应答率可达50%左右,但不同基因型对该治疗反应差异很大。此外,治疗伴随的毒副作用较大,部分病人不能耐受。因此,更有效更安全的抗HCV药物的开发是该领域的一个研究重点。自1999年HCV亚基因型复制子模型建立以来,该复制子系统已广泛地应用于HCV复制机制的深入研究,并在发展和评估抗病毒药物中发挥重要作用；但该培养体系不能产生感染性的病毒颗粒,不可用于HCV感染机制的研究。直到2005年,以HCV2a型JFH1为基础的HCVcc感染系统的建立,有力地推动了对该病毒复制以外生活周期中各环节的研究。这包括早期病毒的进入及晚期病毒的包装和释放以及病毒的感染,从而也为抗病毒药物的研究提供了更多的靶点和新策略。但这两个系统不仅本身存在一定的局限性,而且在具体的实验工作中,传统用来检测HCV RNA复制的实时荧光定量PCR方法耗时费力。对此,本工作采用融合PCR技术在HCV2a嵌合型全长基因组引入荧光素酶报告基因,构建了一系列HCV报告质粒,并于体外合成相应的重组HCV RNA,通过电转染的方法将RNA导入到支持HCV复制的肝癌细胞系Huh7.5,于各时间点收集样品,通过实时定量荧光PCR方法检测病毒RNA在宿主细胞内的复制情况,免疫印迹方法检测病毒蛋白的表达,并且通过不同时间点荧光素酶活性的测定来检测病毒RNA在细胞内的复制情况,同时采用病毒感染实验检测该重组HCV RNA产生感染性病毒颗粒的情况。结果显示：含有荧光素酶Gaussia luciferase的HCV单顺反子报告质粒Gluc-Jc1体外转录合成的相应RNA电转到Huh7.5细胞后,可在细胞内有效复制,并且病毒蛋白表达呈较高水平；病毒感染实验证实培养上清中产生的子代病毒具有感染性,更重要的是细胞内及上清中荧光素酶Gluc活性的变化与HCV RNA复制水平及病毒蛋白表达水平的变化相一致,这些结果表明荧光素酶作为报告基因的HCV细胞感染系统的建立。系统中,通过测定荧光素酶的活性来反映细胞内病毒复制情况的实验方法简便、灵敏。同理,建立了以荧光素酶Firefly luciferase为报告基因的HCV2a嵌合型J6/JFH1细胞感染系统。为进一步验证这种将荧光素酶作为报告基因的HCV细胞感染系统的成功建立和探究其在药物抗病毒效应评估及病毒复制机制等研究中的应用价值,在Gaussia luciferase作为报告基因的HCV 2a嵌合型Jcl细胞感染系统中,取不同剂量的干扰素PEG-IFNa-2a处理被病毒持续感染的Huh7.5细胞,12h后收取样品,检测细胞内和培养上清中的Gluc酶活性,结果显示干扰素处理后Gluc酶活性呈剂量依赖的方式下降,与细胞内HCV RNA水平及病毒蛋白表达一致。这些结果表明荧光素酶作为报告基因的HCV细胞感染系统可用于抗病毒药物的筛选和评价。同时,将荧光素酶Firefly luciferase作为报告基因的HCV 2a嵌合型J6/JFH1细胞感染系统用于研究HCV基因组5’端非编码区（5’UTR）中的第一个茎环对病毒IRES介导的翻译的影响,结果显示荧光素酶活性的测定较免疫印迹法更加灵敏、直观地反映HCV 5’UTR中茎环1对病毒IRES介导的翻译起正向调节作用。综上所述,实验结果表明建立了分别以荧光素酶Gaussia luciferase和Firefly luciferase作为报告基因的丙型肝炎病毒细胞感染系统,将它们于抗病毒药物的评估和病毒自身复制机制的研究中进行了初步的应用,显示较传统检测方法灵敏、简便、直观等优点,这将在一定程度上促进HCV病毒本身复制机制及与宿主细胞相互作用致病机理的研究,并且为抗病毒药物筛选和评价等提供高效的工具。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 材料方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 附录
• 致谢