球毛壳菌chi及glu基因表达和特性研究

论文摘要

球毛壳菌（Chaetomium globosum）是一种重要的生物防治真菌,在生物防治过程中产生大量的细胞壁降解酶类,其中包括几丁质酶和葡聚糖酶。本研究以球毛壳菌（C. globosum）在生物防治过程中产生的几丁质酶基因（chi46）和β-1,3-外切葡聚糖酶基因（glu）为研究对象,分别在转录水平和蛋白水平对其表达进行研究。以6种病原菌细胞壁为碳源,运用实时荧光定量PCR技术检测球毛壳菌（C. globosum）chi46和glu在不同诱导时间及其不同诱导物下的表达量的动态变化。结果表明,chi46基因除在杨树烂皮病菌（Valsa sordida）细胞壁的诱导下始终为下调表达外,在立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）、叶枯病菌（Septoria tritici）、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）细胞壁诱导下均表现了上调表达,分别在第6 d、6 d、6 d、4 d、2 d时表达量达到高峰,表达量分别提高14.22倍、2.16倍、27.67倍、3.92倍、306.55倍,而后表达量逐渐下降。glu并未产生上调表达的应答反应,而主要表现为诱导初期的下调表达。以6种病原菌细胞壁和5种几丁质衍生物为碳源,诱导球毛壳菌（C. globosum）,采用改良的Schales法连续10 d测定发酵液中几丁质酶活性。结果表明,上述11种诱导物均可诱导球毛壳菌（C. globosum）几丁质酶类的产生,其中细胞壁诱导物中以核盘菌（S. sclerotiorum）细胞壁为诱导物产生的酶活性最高,为7.1U;几丁质衍生物中以壳聚糖诱导产生的酶活性最高,为10.2 U;病原菌细胞壁为诱导物产几丁质酶的效果优于几丁质衍生物。以6种病原菌细胞壁为碳源,对球毛壳菌（C. globosum）进行诱导,运用DNS法连续10 d测定发酵液中葡聚糖酶活性。结果表明,以立枯丝核菌（R. solani）、尖孢镰刀菌（F. oxysporum）、叶枯病菌（S. tritici）、杨树烂皮病菌（V. sordida）细胞壁诱导条件下,在诱导的1 d14 d,β-1,3-葡聚糖酶活性缓慢增加,第15 d开始,酶活性表现为迅速升高后缓慢下降的趋势。其中以叶枯病菌（S. tritici）诱导产生的酶活性最高,最高酶活性为1.928 U。CHI46毕赤酵母转化子粗酶液对水稻稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）进行抑菌试验,研究粗酶液抑制病原菌菌落生长、孢子产生及芽管伸长情况。结果表明,病原菌菌落生长抑制率为32.9%;1 cm取样处孢子产生抑制率为80.1%,2 cm取样处孢子产生抑制率为82.21%;在处理浓度为50μl/ml、100μl/ml、150μl/ml的孢悬液中芽管伸长最大抑制率分别为25%、58.33%、77.78%,粗酶液抑菌效果良好,能够有效的抑制稻瘟病菌（P. oryzae）的生长。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 课题研究的目的和意义
• 1.2 国内外研究现状
• 1.2.1 植物病害生物防治发展动态
• 1.2.2 毛壳菌在生物防治中的应用及生防机制
• 1.2.3 几丁质酶研究进展
• 1.2.4 β-1,3-葡聚糖酶研究进展
• 1.3 课题来源及主要研究内容
• 1.3.1 课题来源
• 1.3.2 主要研究内容
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 酶与试剂
• 2.1.4 定量引物设计
• 2.1.5 常用贮液
• 2.1.6 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 实时荧光定量PCR方法检测
• 2.2.2 不同病原菌细胞壁诱导下几丁质酶与葡聚糖酶活性变化
• 2.2.3 重组几丁质酶发酵液的浓缩
• 2.2.4 重组几丁质酶粗酶液抑菌试验
• 第3章 几丁质酶与葡聚糖酶基因诱导表达
• 3.1 诱导后球毛壳菌总RNA的提取与纯化
• 3.2 反转录PCR及其检测
• 3.3 实时荧光定量PCR检测
• 3.3.1 几丁质酶基因chi46 在转录水平上的表达变化
• 3.3.2 葡聚糖酶基因glu在转录水平上表达的变化
• 3.4 关于细胞壁诱导条件下chi46 和glu变化的讨论
• 3.4.1 总RNA提取过程中存在的问题
• 3.4.2 实时荧光定量PCR读板温度的确定
• 3.4.3 实时荧光定量PCR内参的选择
• 3.4.4 几丁质酶基因chi46 定量结果分析
• 3.4.5 葡聚糖酶基因glu定量结果分析
• 3.4.6 大豆疫霉诱导试验结果分析
• 3.5 本章小结
• 第4章 几丁质酶与葡聚糖酶诱导活性变化
• 4.1 几丁质酶酶活测定
• 4.1.1 几丁质酶活标准曲线测定
• 4.1.2 六种病原菌细胞壁诱导下的几丁质酶活性比较
• 4.1.3 几丁质衍生物诱导下几丁质酶活性比较
• 4.2 葡聚糖酶酶活测定
• 4.2.1 葡聚糖酶活标准曲线测定
• 4.2.2 六种病原菌细胞壁诱导下葡聚糖酶活性比较
• 4.3 关于细胞壁诱导下CHI和GLU酶活变化的讨论
• 4.3.1 病原菌的培养与细胞壁的处理
• 4.3.2 关于几丁质酶的活力测定方法的选择
• 4.3.3 几丁质酶活测定结果分析
• 4.3.4 葡聚糖酶活测定结果分析
• 4.4 本章小结
• 第5章 重组几丁质酶发酵液的抑菌试验
• 5.1 重组 CHI46 发酵液的浓缩
• 5.2 重组 CHI46 粗酶液抑菌试验
• 5.2.1 抑制稻瘟病菌落生长分析
• 5.2.2 抑制稻瘟病菌产生分生孢子分析
• 5.2.3 抑制稻瘟病芽管伸长的分析
• 5.3 关于分离纯化与重组酶抑菌试验的讨论
• 5.3.1 纯化过程中遇到的问题及解决方法
• 5.3.2 非重组蛋白粗酶液抑菌作用的探索
• 5.3.3 稻瘟病菌芽管形成条件
• 5.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢