论文摘要
背景与目的:人肝脏胶原样凝集素-1（collectin liver 1,CL-L1）基因首先由Ohtani等克隆获得,为胶原样凝集素家族的新成员。推测该序列具有典型的胶原样凝集素特点,由N端富含半胱氨酸区、胶原样区、颈区和糖识别区（carbohydrate recognitiondomain,CRD）构成。已发现的胶原样凝集素多数为分泌蛋白,是固有免疫的重要分子,它们通过凝集病原微生物、激活补体、调理作用、激活吞噬作用和抑制病原生长等参与机体的免疫防御反应。但CL-L1为唯一发现的胞浆内蛋白,对它在人体组织表达谱及功能了解较少。为此,本研究构建了CL-L1的颈区-糖识别区原核表达质粒,在E.coli BL21中表达,经亲和层析纯化,免疫家兔制备了多克隆抗体,为进一步研究CL-L1在人体组织表达谱及其结构和功能奠定基础。方法:从已构建的含有全长CL-L1基因序列的pcDNA3.1/myc-His-CL-L1重组载体中,采用PCR方法扩增人CL-L1颈区.糖识别区目的基因片段,将目的片段平端插入pT7 blue克隆载体,酶切获得目的片段定向插入pRSET-C中,构建原核表达载体,在E.coli BL21中进行原核表达,镍亲和层析柱纯化融合蛋白,免疫家兔,制备多克隆抗体。采用ELISA检测抗体效价,免疫印迹法检测蛋白纯度和抗体的特异性。结果:成功构建了人CL-L1颈区-糖识别区原核表达载体pRSET-C/NECK-CRD△K,在E.coli BL21中表达,镍亲和层析柱纯化,得到相对分子质量19 200的融合蛋白,免疫家兔后收获抗血清,ELISA显示抗体效价为1/20000,具有高度特异性,免疫印迹结果显示制备的多抗可以与重组人CL-L1颈区-糖识别区蛋白特异性结合。结论:本研究获得了人CL-L1颈区-糖识别区纯化蛋白,制备了人CL-L1颈区.糖识别区多克隆抗体,为CL-L1的结构、组织表达谱和功能的研究奠定了基础。
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相关论文文献
- [1].人CL-L1基因片段的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备[J]. 免疫学杂志 2009(01)
标签：人肝脏胶原样凝集素论文; 原核表达论文; 蛋白质纯化论文; 抗体制备论文;