谷氨酰t-RNA还原酶基因（hemA）的高效表达及其对5-ALA合成的影响

论文摘要

氨基乙酰丙酸（5-aminolevuinic acid，5-ALA）是生物体内合成四吡咯类物质(血红素、细胞色素、维生素B12等)的前体。5-ALA作为光动力药物，可以用来诊断治疗皮肤癌、食道癌等疾病。在农业生产中可以作为除草剂、杀虫剂、壮苗剂、增产剂，还能提高植物的抗盐、抗冻能力。近些年国内外学者对其化学合成进行了大量研究，相比之下生物合成具有原料价廉易得，环境相容性好的特点，成为近几年研究热点。5-ALA生物合成两条途径，C4途径由琥珀酰CoA和甘氨酸在限制性酶氨基乙酰丙酸合成酶（ALAS）催化下缩合生成5-ALA。C5途径以谷氨酸为前体，在谷氨酰tRNA合成酶，谷氨酰tRNA还原酶，谷氨酸-1-半醛转氨酶（GSA-ATase）系列酶的催化下最终生成5-ALA。从谷氨酸到5-ALA的三步反应中，限速步骤为谷氨酰tRNA还原酶（HemA）催化的谷氨酰tRNA还原为GSA的反应。在生物体内两分子的5-ALA由5-氨基乙酰丙酸脱水酶催化缩合生成胆色素原（PBG），进而生成四吡咯尿卟啉原Ⅲ（UrogenⅢ），尿卟啉原Ⅲ则是生物体内所有四吡咯类物质的共同前体。枯草芽孢杆菌（Bacillus.subtilis）和大肠杆菌（Escherichia.coli）均采用C5途径合成5-ALA。本文以NCBI数据库（M57676）的B.subtilis基因组中的hemA基因序列设计PCR引物，经PCR反应得到hemA基因片段，并克隆到载体pET28a上，得到重组质粒pET28a-hemA，将其电转化至E.coli宿主BL21（DE3），进行IPTG诱导，实现了hemA基因的高效表达，对其蛋白纯化。SDS-PAGE电泳分析，表达的目的蛋白占总蛋白的20％。通过分离纯化得到谷氨酰tRNA还原酶。重组菌发酵液上清中5-ALA浓量达36.6mg／L，菌液呈红色，过筛试验和紫外分光光度检测验证显色的为卟啉类物质，实验表明，表达的重组蛋白具有生理活性并促进了大肠杆菌中5-ALA的合成和代谢。以重组菌的发酵液中5-ALA产量为目标，对发酵条件进行了初步研究。分别对培养条件中的培养基、摇瓶装液量、接种量三个指标，和诱导条件中的诱导时机、IPTG浓度，诱导温度三个指标进行比较实验。结果显示，最佳培养条件为以LB培养基为基础，250ml三角瓶，分装30ml LB培养基，接种比例为1：50，最优的诱导时机为菌体对数生长期期，诱导剂IPTG的浓度为0.4mM，诱导后的培养温度为37℃，诱导后12h取样，发酵液中5-ALA浓度最高可达52.1mg／L。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 氨基乙酰丙酸的天然存在
• 1.2 5-ALA的作用机理及其在农业生产中的应用
• 1.2.1 5-ALA在植物中的作用机理
• 1.2.1.1 促进光合作用
• 1.2.1.2 影响呼吸作用
• 1.2.1.3 促进植物组织分化
• 1.2.1.4 启动细胞过氧化反应
• 1.2.2 5-ALA在农业中的潜在应用
• 1.2.2.1 用作新型农田除草剂
• 1.2.2.2 植物生长调节剂
• 1.2.2.3 无公害杀虫剂
• 1.2.2.4 5-ALA与草坪草
• 1.3 5-ALA在医学领域的应用
• 1.3.1 5-ALA作为抗癌药物
• 1.3.2 检验铅中毒的主要试剂
• 1.4 5-ALA的生物合成途径
• 1.4.1 碳四途径（Shemin pathway）
• 1.4.2 碳五途径(（C5 pathway）
• 1.5 氨基乙酰丙酸的合成方法
• 1.5.1 化学合成
• 1.5.1.1 以马尿酸和琥珀酸为原料的合成工艺
• 1.5.1.2 以吡啶,糠醛等杂环物质的衍生物为反应原料
• 1.5.1.3 以乙酰丙酸及其衍生物为原料
• 1.5.2 生物合成
• 1.5.2.1 诱变育种法
• 1.5.2.2 基因工程菌生产5-ALA
• 1.6 展望
• 第二章 试验研究
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种与质粒
• 2.1.2 生化试剂与分子生物学试剂
• 2.1.3 实验所需各种酶
• 2.1.4 枯草杆菌hemA基因序列
• 2.1.5 主要试剂盒
• 2.1.6 培养基及溶液
• 2.1.6.1 大肠杆菌和枯草杆菌生长培养基
• 2.1.6.2 抗生素用量（终浓度）
• 2.1.6.3 主要溶液与缓冲液的配制
• 2.1.7 主要的仪器设备见表2-1
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 质粒DNA的提取
• 2.2.2 枯草杆菌基因组DNA的提取
• 2.2.3 PCR扩增谷氨酰t-RNA还原酶基因
• 2.2.4 DNA片段的纯化回收
• 2.2.5 酶切体系与连接体系
• 2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 2.2.6.1 所需要的溶液
• 2.2.6.2 操作步骤
• 2.2.6.3 大肠杆菌感受态细胞DNA转化
• 2.2.7 蛋白质的SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2.7.1 材料
• 2.2.7.2 细胞抽提物的制备
• 2.2.7.3 SDS-PAGE上样样品制备
• 2.2.7.4 SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制
• 2.2.7.5 考马斯亮蓝对SDS聚丙烯酰胺凝胶进行染色
• 2.2.8 蛋白质的纯化
• 2.2.8.1 Ni2+亲和柱的制备
• 2.2.8.2 溶液配制
• 2.2.8.3 方法
• 2.2.9 氨基乙酰丙酸的分析
• 2.2.9.1 试剂
• 2.2.9.2 标准曲线的绘制
• 2.2.9.3 分析步骤
• 2.2.10 卟啉类物质的定性检测
• 2.2.10.1 试剂
• 2.2.10.2 方法
• 第三章 结果与分析
• 3.1 载体的构建
• 3.2 蛋白质的表达
• 3.2.1 谷氨酰t-RNA还原酶的诱导表达
• 3.2.2 谷氨酰t-RNA还原酶的纯化
• 3.2.3 氨基乙酰丙酸的产量测定
• 3.2.4 卟啉类物质定性检测
• 3.3 重组菌生产5-ALA发酵条件的初步研究
• 3.3.1 培养基的优化
• 3.3.2 诱导条件的选择
• 3.3.2.1 诱导时机的选择
• 3.3.2.2 诱导剂浓度对5-ALA产量的影响
• 3.3.2.3 诱导温度对5-ALA产量的影响
• 3.3.3 培养方式的选择
• 3.3.3.1 接种量对5-ALA产量的影响
• 3.3.3.2 摇瓶装液量对5-ALA产量的影响
• 第四章 结论与讨论
• 4.1 讨论
• 4.2 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介