肌球蛋白X在神经轴突生长和导向中作用的研究

论文摘要

肌球蛋白X（MyoX）是1994年在牛蛙的内耳中发现的、脊椎动物所特有的细胞骨架蛋白,在肾、肝、脑等大多数组织中都有表达。有趣的是在神经系统中既表达完整的MyoX蛋白,又表达一种无头型的MyoX,目前并不明确其在神经发育中的生物学意义。MyoX显著的特点是定位于细胞丝足的顶端和片状伪足的边缘。过表达MyoX可明显增加丝足的数目。而过表达MyoX尾部区导致细胞丝足数减少或消失,因此,无头型MyoX也作为‘显性失活’来研究MyoX的功能。近来有研究表明,MyoX与Netrin-1的受体DCC/neogenin相互作用,参与Netrin-1介导的信号通路,其在神经轴突导向中的作用尚待深入。利用构建的MyoX和系列缺陷型表达载体转染NG108-15细胞,过表达MyoX-Fl和头部结构域的NG108-15细胞产生大量丝足,且丝足数目与长度明显增加,过表达MyoX-tail蛋白的细胞几乎没有丝足,细胞呈现圆球状,内源性肌球蛋白X在NG108-15细胞的边缘表达量很高。在离体培养的小鼠大脑皮层神经细胞中,内源MyoX与DCC在神经细胞中分布几乎一致,Netrin-1诱导神经细胞后,神经轴突出现大量分支,且肌球蛋白X与DCC仍然具有共定位现象。进一步,我们将构建的MyoX和系列缺陷型表达载体与pFlag-DCC或pFlag-neogenin共转染HEK 293T细胞,利用Protein-G进行免疫共沉淀分析,研究肌球蛋白X与DCC或neogenin之间的相互作用情况。结果表明,DCC和neogenin是通过与肌球蛋白X的尾部区相互作用的,MyoX参与了Netrin-1介导的神经轴突导向过程。另外,体外培养的嗅球外植体被用来探讨MyoX在神经细胞迁移中的作用,培养50小时的外植体,即有大量的神经细胞从外植体向周围迁移,而在培养基中添加MyoX的抗体阻断神经细胞迁移的过程,证明MyoX抗体抑制了神经细胞的迁移。综上所述,MyoX的头部区对细胞丝足的生长是重要的。MyoX与DCC共定位和相互作用,表明MyoX参与了神经细胞轴突导向的Netrin-1—DCC信号通路,并且是神经细胞的迁移中重要的影响因素。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1. 引言
• 1.1 轴突生长和导向是神经细胞迁移中的重要环节
• 1.2 神经细胞轴突导向因子介导轴突的生长和导向
• 1.3 Netrin 是双功能的轴突导向因子
• 1.4 肌球蛋白X 参与Netrin 介导的神经轴突生长和导向
• 1.5 立题依据
• 2. 材料和方法
• 2.1 动物材料和细胞株
• 2.2 表达载体
• 2.3 化学试剂
• 2.4 抗体
• 2.5 仪器
• 2.6 小鼠大脑皮层神经细胞的原代分离和培养
• 2.6.1 准备
• 2.6.2 胚胎小鼠大脑皮层神经细胞的原代分离与培养
• 2.7 培养细胞的免疫荧光染色
• 2.8 NG108-15 细胞的培养及转染
• 2.8.1 NG108-15 细胞的培养及诱导分化
• 2.8.2 电转化法转染NG108-15 细胞
• 2.9 嗅球外植体的分离培养
• 2.9.1 实验前的准备工作
• 2.9.2 新生小鼠嗅球外植体分离
• 2.9.3 细胞团的制备与抗体阻断实验
• 2.10 免疫共沉淀分析
• 2.10.1 磷酸钙法转染HEK 293T 细胞
• 2.10.2 细胞蛋白提取
• 2.10.3 蛋白质免疫印迹分析
• 2.10.4 免疫共沉淀（Co-IP）分析蛋白质之间的相互作用
• 3. 结果
• 3.1 肌球蛋白X 在NG108-15 细胞的丝足顶端积累
• 3.2 过表达肌球蛋白X 对细胞丝足的影响
• 3.3 肌球蛋白X 尾部区与DCC 相结合
• 3.4 内源性肌球蛋白X 与DCC 在神经细胞中的定位
• 3.5 利用嗅球外植体研究肌球蛋白X 对神经细胞迁移的影响
• 3.5.1 嗅球外植体培养体系的建立
• 3.5.2 嗅球外植体的免疫荧光染色
• 3.5.3 细胞团的制备与抗体阻断实验结果
• 4. 讨论
• 肌球蛋白 X 促进细胞丝足的生长
• 肌球蛋白 X 在轴突导向中的作用研究
• 肌球蛋白 X 在神经细胞迁移的体外研究
• 5. 结论
• 参考文献
• 致谢