毕赤酵母木糖代谢缺陷工程菌株构建及其应用

论文摘要

木糖作为木糖醇原料和功能性食品添加剂,其市场需求越来越大。木糖生产的主要原料来自玉米芯和农作物秸秆,由于水解液含有多种有机酸、糖类等,使得木糖纯化工艺较复杂,因此,如何简单快速纯化木糖是制备木糖的关键技术。本研究构建了一株木糖代谢缺陷的毕赤酵母,以期实现用微生物利用玉米芯水解液的营养成分,实现木糖纯化和副产物增值的双重目的。主要研究成果如下：1、研究了毕赤酵母生孢条件,结果表明最适毕赤酵母生孢培养基成分为10g/L乙酸钠,6 g/L氯化钾,10 g/L葡萄糖,1 mL/L微量元素,20 g/L琼脂,28℃培养箱中培养7天后其生孢率能达到72%。2、经过生孢后的菌泥于3%蜗牛酶30℃处理2 h,58℃水浴12 min后获得了单倍体菌株。3、采用同源重组的方法敲除了木糖还原酶基因xyl1,获得了木糖代谢缺陷菌株HM,该菌株的木糖发酵能力已丧失。4、研究了时间、温度以及硫酸浓度等多个因素对玉米芯水解的影响,得出最适酸水解玉米芯条件为：0.5%的硫酸浓度在85℃下水解48 h左右,还原糖得率约30%左右。5、将毕赤酵母木糖缺陷型菌株HM接入到玉米芯水解液中发酵培养,在未添加其他营养成分的条件下,能够利用玉米芯水解产生的葡萄糖良好生长；相对于野生型来说,不能利用除葡萄糖之外的还原糖,而野生型菌株在消耗完葡糖糖之后,仍能利用剩余的还原糖进行生长。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 毕赤酵母基因工程现状
• 1.1.1 毕赤酵母作为外源表达宿主的优点
• 1.1.2 毕赤酵母作为宿主表达的外源蛋白
• 1.2 木糖代谢途径
• 1.2.1 能够利用木糖的微生物
• 1.2.2 木糖代谢途径
• 1.2.3 真菌木糖代谢途径中的关键酶及其基因
• 1.3 玉米芯水解提糖工艺的现状
• 1.3.1 酶法水解
• 1.3.2 酸水解方法
• 1.3.3 目前研究中的新型水解方法
• 1.4 木糖的应用
• 1.5 本研究的目的、意义和研究内容
• 1.6 课题的技术路线图
• 第2章 毕赤酵母生孢诱导因子的研究及单倍体的制备
• 2.1 前言
• 2.2 材料
• 2.2.1 菌种
• 2.2.3 培养基
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 毕赤酵母的活化
• 2.3.2 毕赤酵母的培养
• 2.3.3 子囊孢子诱导温度的确定
• 2.3.4 子囊孢子的诱导
• 2.3.5 子囊孢子的观察
• 2.3.6 子囊孢子的释放
• 2.3.7 单倍体的分离
• 2.3.8 单倍体的鉴定
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 毕赤酵母的预培养时间对生孢的影响
• 2.4.2 温度对毕赤酵母生孢的影响
• 2.4.3 各种无机离子对毕赤酵母生孢的影响
• 2.4.4 碳源对毕赤酵母生孢的影响
• 2.4.5 微量元素的影响
• 2.4.6 蜗牛酶浓度对子囊孢子释放及单倍体获得率的影响
• 2.4.7 蜗牛酶处理时间对子囊孢子释放的影响
• 2.4.8 酶解液热处理时间的影响
• 2.4.9 有机试剂裂解子囊孢子结果
• 2.5 小结
• 第3章 毕赤酵母xyl1基因敲除工程菌株的构建及鉴定
• 3.1 前言
• 3.2 材料
• 3.2.1 菌株及质粒
• 3.2.2 常用的酶和生化试剂
• 3.2.3 试剂与仪器
• 3.3 培养基和生化试剂
• 3.3.1 培养基
• 3.3.2 试剂的配制
• 3.4 试验方法
• 3.4.1 菌株培养
• 3.4.2 DNA的提取
• 3.4.3 基因克隆方法
• 3.4.4 基因测序
• 3.4.5 基因敲除方法
• 3.4.6 P.pichia酵母转化及筛选
• 3.4.7 木糖和葡萄糖测定方法
• 3.5 结果与分析
• 3.5.1 Xyll基因克隆
• 3.5.2 Pichia xyl1基因敲除菌株分子鉴定
• 3.5.3 突变株木糖发酵能力
• 3.6 小结
• 第4章 玉米芯酸水解工艺研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验试剂及仪器
• 4.3 试验方法
• 4.3.1 玉米芯水解的预处理
• 4.3.2 确定玉米芯水解最适硫酸浓度
• 4.3.3 确定最适玉米芯水解温度
• 4.3.4 逆流处理水解玉米芯
• 4.3.5 乙酸水解玉米芯
• 4.3.6 玉米芯水解规模放大处理
• 4.3.7 还原糖和葡萄糖的测定方法
• 4.3.8 水解液干重的测量方法
• 4.3.9 玉米芯水解率的计算方法
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 预处理和酸水解时间的影响
• 4.4.2 硫酸浓度对玉米芯水解的影响
• 4.4.3 温度对酸水解玉米芯的影响
• 4.4.4 逆流处理对水解率的影响
• 4.4.5 硫酸和乙酸水解玉米芯的效果比较
• 4.4.6 扩大酸水解玉米芯规模的结果
• 4.5 小结
• 第5章 毕赤酵母木糖代谢缺陷菌株应用
• 5.1 前言
• 5.2 材料
• 5.2.1 菌株
• 5.2.2 试剂及仪器
• 5.2.3 培养基及试剂的配制
• 5.3 试验方法
• 5.3.1 菌种的活化
• 5.3.2 碳源利用情况调查
• 5.3.3 氮源利用情况调查
• 5.3.4 高渗培养验证
• 5.3.5 工程菌株发酵水解液试验
• 5.3.6 糖和菌湿重的测定方法
• 5.4 结果与分析
• 5.4.1 碳源调查结果
• 5.4.2 氮源调查结果
• 5.4.3 高渗培养的结果
• 5.4.4 工程菌株发酵玉米芯水解液的结果
• 5.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间所发表的论文
• 致谢