Pseudomonas putida S1海藻糖合成酶基因在大肠杆菌中的表达及其条件研究

论文摘要

海藻糖是一种非还原性二糖,它广泛存在于自然界中,具有独特的理化性质和生物学功能,使其在食品工业、化妆品工业、医药工业、农业、分子生物学等领域有广泛的应用前景。海藻糖合成酶能够通过分子内的转糖苷作用转化麦芽糖生成海藻糖,是海藻糖合成最重要的途径之一。利用PCR技术从恶臭假单胞杆菌S1中成功扩增出海藻糖酶基因（treS）基因。通过TA克隆,将扩增片段与pMD19-T载体连接,转化E. coli JM109,蓝白斑筛选阳性菌落,得到重组质粒pMD-TS2。质粒经酶切鉴定、测序后,用BamHI、HindⅢ同时双酶切重组质粒pMD-TS2和表达载体pQE30T,在T4DNA连接酶作用下,构建重组质粒pQE-TS2。酶切鉴定后,将重组质粒pQE-TS2转化E. coli M15并进行了IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE分析,酶蛋白的分子量大小为77KD,但主要以包含体的形式存在于宿主细胞中。通过在摇瓶条件下的优化,得到最佳培养和诱导条件为:37℃菌体生长至OD600≈0.6时,加入诱导剂IPTG至终浓度0.01mmol/L,20℃诱导20h,目的蛋白的表达量达可占可溶性总蛋白18.6%,发酵液酶活达到1.9U /mL,为原始菌株的50倍。通过单因素优化实验,得到经济适用、易于扩大培养重组菌的培养基配方:葡萄糖10 g/L,硫酸铵3 g/L,蛋白胨1.5g/L,柠檬酸1.5g/L,磷酸二氢钾12.5 g/L,MgSO4·7H2O 1 g/L,TES 5 mL/L,pH为7.0。在5 L台式搅拌发酵罐中,控制溶氧在30%以上,重组菌的对数生长中期流加碳源和氮源,发酵结束菌体干重为17.2g/L,目的蛋白的表达量占胞内可溶性蛋白的10.2%,单位体积内高密度发酵的海藻糖合成酶表达量是摇瓶发酵的6.9倍。重组海藻糖合成酶能够一步法将底物麦芽糖转化成海藻糖。通过对缓冲液pH,温度,反应时间,底物浓度,加酶量对麦芽糖转化率的影响研究,得到了该酶最适pH 8.5,最适温度20℃,在30℃以下和pH7.59.0之间保持较好的稳定性,并需在低温下保存。通过正交实验考察加酶量、pH、底物浓度、反应温度等因素,确立了海藻糖合成酶最佳的转化条件为:在10℃、pH8.5条件下反应36h、加酶量是6U/g麦芽糖,按此可以获得70.1%的海藻糖产率。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 海藻糖的理化性质
• 1.2 海藻糖的生物学功能
• 1.2.1 “水替代”假说
• 1.2.2 “玻璃态”假说
• 1.2.3 “优先排阻”假说
• 1.3 海藻糖的代谢途径以及有关酶的性质
• 1.3.1 OstA-OstB 途径
• 1.3.2 TreY-TreZ 途径
• 1.3.3 TreS 途径
• 1.3.4 其它途径
• 1.4 海藻糖的应用
• 1.4.1 在食品和保健品方面
• 1.4.2 医药方面
• 1.4.3 化妆品方面
• 1.4.4 农业领域的应用
• 1.5 国内外海藻糖生产研究进展
• 1.6 立题背景和意义
• 1.7 课题研究内容
• 第二章 海藻糖合成酶编码基因TRES 的克隆与表达
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌株、质粒及培养基
• 2.1.2 酶、化学试剂及缓冲液
• 2.1.3 主要仪器和材料
• 2.1.4 方法
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 重组质粒pQE-TS2 的构建，筛选和鉴定
• 2.2.2 重组菌（M15/ pQE-TS2）的构建和表达产物的SDS-PAGE 分析
• 2.2.3 质粒pQE-TS2 的稳定性
• 2.3 本章小结
• 第三章 重组E.COLI M15（PQE-TS2）的培养与表达
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 主要仪器
• 3.1.4 方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 重组菌的摇瓶生长曲线
• 3.2.2 诱导条件对重组海藻糖合成酶表达水平的影响
• 3.2.3 培养基组分对重组菌生长的影响
• 3.3.4 5L 台式发酵罐中重组菌培养的初步研究
• 3.3 本章小结
• 第四章 重组海藻糖合成酶转化条件的研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 试剂
• 4.1.4 主要仪器
• 4.1.5 方法
• 4.2 结果和讨论
• 4.2.1 酶的保存稳定性
• 4.2.2 酶反应最适温度及热稳定性
• 4.2.3 酶反应最适pH 及pH 稳定性
• 4.2.4 温度对酶反应转化率的影响
• 4.2.5 底物浓度对酶反应转化率的影响
• 4.2.6 加酶量对酶反应转化率的影响
• 4.2.7 正交实验优化
• 4.2.8 酶反应产物的TLC 检测
• 4.3 本章小结
• 第五章 结论与展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 课题展望
• 致谢
• 参考文献
• 作者在攻读硕士学位期间发表的论文