重组褐藻胶裂解酶基因工程菌酶液制备及褐藻胶水解条件研究

论文摘要

褐藻胶是褐藻中含量最丰富的多糖,理论上可以通过将其降解成褐藻胶寡糖而后被微生物利用生产乙醇,另外,褐藻胶寡糖还有很多独特的生理活性,在食品、医疗、农业等行业都具有巨大的应用前景。然而目前发现的褐藻胶裂解酶产生菌酶产量低,酶活力小,因此褐藻胶寡糖还不能进行工业化生产。获得高活性的褐藻胶裂解酶是制备褐藻胶寡糖的关键步骤。若能提高褐藻胶裂解酶的产量及酶活力,制备出大量褐藻胶寡糖则在多方面都具有重要的意义。随着基因工程的发展,将褐藻胶裂解酶的基因克隆到适于工业化生产的宿主细胞,例如大肠杆菌,是获得高产量的褐藻胶裂解酶的重要途径。然而虽然已有超过20种褐藻胶裂解酶的基因得到克隆和测序,并构建出多种重组褐藻胶裂解酶基因工程菌,但目前所构建的重组褐藻胶裂解酶基因工程表达水平还比较低。为了提高重组基因工程菌褐藻胶裂解酶的产量,有必要对基因工程菌的发酵过程进行动力学研究,通过发酵工程技术生产更多的褐藻胶裂解酶。本文首次对褐藻胶裂解酶重组大肠杆菌的分批发酵过程进行动力学研究。分析了不同初糖浓度和接种量对该基因工程菌发酵产酶的影响,对该工程菌在5L发酵罐内分批发酵过程进行分析,测定其发酵液中菌体浓度、残糖浓度及酶活力随时间变化的情况,按照相应的动力学方程通过Origin软件对实验数据进行拟合,建立菌体生长、产物合成及基质消耗动力学模型。实验结果表明该基因工程菌分批发酵最适初糖浓度为10g/L,最适接种量为5%,其褐藻胶裂解酶的形成与菌体生长只是部分偶联,发酵类型属于混合型。建立了菌体生长、产物合成及基质消耗动力学模型分别如下:所建立的模型能较好地反映基因工程菌的分批发酵动力学规律,对于该重组褐藻胶裂解酶基因工程的发酵放大及发酵过程优化控制具有一定的指导意义。由于本文所用重组褐藻胶裂解酶基因工程菌所产的褐藻胶裂解酶为胞内酶,为提取保持高活性的褐藻胶裂解酶需采用合适的方法将菌体破碎。超声波法操作简单,适合基因工程菌的破碎,适合实验室规模的生产。然而,高强度的超声波会产生热效应,另外,空化泡破裂时产生瞬时高温及高压导致酶失活。因此,有必要研究超声波破碎的条件,以获得更高产率的具有酶活性的褐藻胶裂解酶。本文考察了破碎强度、总工作时间及NaCl浓度对基因工程菌褐藻胶裂解酶提取效果的影响,以酶活力为指标,通过对上述3个影响因素进行单因素试验及正交试验,确定最佳基因工程菌的超声波破碎条件。根据实验结果确定最优破碎条件为:菌液浓度40mg/ml,菌液体积50ml,超声波工作时间4s,间歇时间8s,超声波破碎强度50%,总工1.35 14.81dX XXdt= ??? ????、ddPt = ?0 .2 ddXt + 0.2X、? ddSt = 0.15 1ddSt +0.095X作时间6min,NaCl浓度为0.15mol/L。在该条件下获得褐藻胶裂解酶粗酶液的酶活为21U/ml。在实验考查范围内,NaCl浓度对酶活影响较大,而对细胞破碎情况及蛋白质的释放几乎没有影响。为了制备更多的褐藻胶寡糖,结合了物理降解法和酶解法对褐藻胶进行降解。分别研究了加热加压即高压灭菌处理（121℃,20min）及超声波处理（强度60%,工作/间隙时间:4s/8s,总工作时间5min）及所制备的褐藻胶裂解酶粗酶液对褐藻胶降解的影响,以水解液中还原糖含量为指标对高压灭菌、超声辐射及褐藻胶裂解酶粗酶液降解褐藻胶的效果进行比较。然后通过单因素-正交试验研究水解时间、底物浓度、加酶量、水解温度及pH值对褐藻胶降解的影响,确定最适褐藻胶水解条件。实验结果显示所制备的褐藻胶裂解酶粗酶液的酶活力较低,其对褐藻胶的水解效果还不如高压灭菌的效果好。而超声辐射的效果并不明显。如何提高褐藻胶裂解酶的酶活是大量制备褐藻胶的关键点,还需要更多的深入研究。得到最优水解条件为:将浓度为1.5%、pH值为7.0的海藻酸钠溶液于121℃高压灭菌处理20min,加入酶液量占反应体积的35%,水解温度为35℃,水解5h。该条件下水解产物还原糖含量为670.104μg/ml。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 1.1 褐藻胶寡糖的应用
• 1.2 褐藻胶寡糖的制备方法
• 1.2.1 化学降解法
• 1.2.2 物理降解法
• 1.2.3 生物学降解法
• 1.3 褐藻胶裂解酶的生产和制备
• 1.3.1 褐藻胶裂解酶的来源
• 1.3.2 褐藻胶裂解酶基因工程菌研究进展
• 1.3.3 发酵动力学研究
• 1.3.4 细胞破碎方法
• 1.4 本课题的研究目的、意义和内容
• 1.4.1 研究目的和意义
• 1.4.2 研究内容
• 第二章 重组褐藻胶裂解酶基因工程菌分批发酵动力学研究
• 2.1 引言
• 2.2 材料与设备
• 2.2.1 菌种
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 实验试剂
• 2.2.4 仪器及设备
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 培养方法
• 2.3.2 不同葡萄糖浓度对工程菌发酵的影响
• 2.3.3 不同接种量对工程菌发酵的影响
• 2.3.4 菌体收集及粗酶液制备
• 2.3.5 发酵罐采样及分析方法
• 2.3.6 发酵动力学模型研究方法
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 菌浓度与菌液 OD 值标准曲线绘制
• 2.4.2 葡萄糖标准曲线绘制
• 2.4.3 不同葡萄糖浓度对工程菌发酵的影响（摇瓶培养）
• 2.4.4 不同接种量对工程菌发酵的影响（发酵罐培养）
• 2.4.5 工程菌分批发酵动力学模型的建立及分析
• 2.5 小结
• 第三章 重组褐藻胶裂解酶基因工程菌超声波破碎条件优化
• 3.1 引言
• 3.2 材料与设备
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 试剂
• 3.2.4 仪器与设备
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 培养方法
• 3.3.2 菌体收集及粗酶液制备
• 3.3.3 分析方法
• 3.3.4 超声波破碎条件确定
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 单因素试验
• 3.4.2 正交试验
• 3.5 小结
• 第四章 褐藻胶水解条件研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与设备
• 4.2.1 实验试剂
• 4.2.2 仪器及设备
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 还原糖测定方法
• 4.3.2 高压灭菌处理及超声波处理对褐藻胶降解的影响
• 4.3.3 酶解法与高压灭菌及超声波处理对褐藻胶降解效果对比
• 4.3.4 褐藻胶酶解条件优化单因素试验
• 4.3.5 褐藻胶酶解条件优化正交试验
• 4.3.6 平均聚合度测定
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 高压灭菌处理及超声波破碎处理对褐藻胶降解的影响
• 4.4.2 高压灭菌及超声波处理对褐藻胶降解效果对比结果
• 4.4.3 褐藻胶酶解条件优化单因素试验结果
• 4.4.4 褐藻胶酶解条件优化正交试验结果
• 4.5 小结
• 第五章 总结
• 参考文献
• 致谢