血脑屏障与脑内β淀粉样蛋白1-40外流转运的实验研究

论文摘要

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是发生于老年和老年前期、以进行性认知功能障碍及行为损害为特征的中枢神经系统变性疾病。神经毒性β淀粉样蛋白（βamyloid，Aβ）在脑内的聚集和异常沉积是AD发病的关键环节，针对Aβ神经毒性治疗AD成为近年来AD研究热点之一。脑内Aβ聚集和沉积源于Aβ产生和／或清除失衡，晚发性AD脑内Aβ沉积与Aβ清除障碍密切相关。脑内Aβ的清除途径主要包括细胞外降解、细胞内吞和转运清除出脑，外流转运绝大部分是经血脑屏障（Blood-Brain Barrier，BBB）途径实现。晚发性AD患者脑内出现的Aβ沉积可能与BBB上Aβ转运和／或脑内降解障碍有关。目前研究发现，低密度脂蛋白受体相关蛋白（Low-density lipoprotein receptor-relatedprotein，LRP）与AD发病密切相关。脑内表达的LRP主要有两种亚型，即LRP-1与LRP-2。LRP-1的生理功能目前尚不十分清楚。体外实验发现，细胞表面的LRP-1能够与结合型Aβ结合。AD患者LRP-1阳性表达的脑微血管明显减少，并且与AD患者脑内局部Aβ1-40与Aβ1-42的沉积相关，由此提出脑内βB经BBB的外流转运可能是由脑微血管内皮细胞上的LRP-1介导。LRP-1很可能就是BBB上参与脑内Aβ1-40外流清除的转运体。1999年以来Aβ主动免疫或被动免疫治疗APP转基因小鼠发现，Aβ免疫治疗能够促使脑内Aβ外流转运，并减少脑内老年斑形成，由此提出Aβ“外周沉积”的治疗策略。但是，Aβ免疫治疗Ⅱ期临床试验过程中部分受试者出现了严重的中枢神经系统炎症表现。那么，根据BBB上可能存在的Aβ1-40外流转运途径，是否能寻找其他不经BBB通透、但能在外周与血浆Aβ1-40结合的物质以降低血浆游离型Aβ1-40的浓度，从而改变脑-血液之间Aβ1-40的动态平衡，促进脑内Aβ1-40的大量外流，达到Aβ“外周沉积”的效果，同时又不会出现Aβ免疫治疗可能伴随的中枢神经系统炎症反应呢?本研究首先通过RT-PCR和Western Blot检测脑微血管内皮细胞株LRP-1的表达。然后通过人脐静脉内皮细胞与星形胶质细胞共培养建立的BBB体外模型以及小鼠体内实验观察脑内Aβ1-40经BBB外流转运的特点，并通过抗LRP-1抗体、LRP-1受体拮抗剂——受体相关蛋白（receptor associated protein，RAP）和Aβ1-40吸附剂凝溶胶蛋白干预，进一步探讨LRP-1与脑内Aβ1-40经BBB外流转运的关系，以及外周使用凝溶胶蛋白对脑内Aβ1-40外流转运的影响，初步探讨“外周沉积”治疗策略的可行性。第一部分血脑屏障体外模型的建立与评价目的：建立一种相对简便而可靠的血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）体外模型。方法：将人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）与小鼠星形胶质细胞（astrocyte，As）进行共培养建立BBB体外模型。电镜技术观察该模型的形态特征，跨内皮细胞电阻抗测定观察模型的物理屏障功能，14C-蔗糖与125I-牛血清白蛋白经该模型的通透性测定观察模型的屏障功能。结果：共培养后HUVEC间出现了紧密连接，第7天跨内皮细胞电阻达（267±24）Ω/cm2。BBB特征酶γ-谷氨酰转肽酶含量为（12.41±1.71）U／mg蛋白，与第2代HUVEC（2.76±1.00 U／mg蛋白）的差异有统计学意义（P＜0.01）。共培养和单层培养HUVEC对14C-蔗糖的通透系数分别为（0.93±0.32）×10-3、（8.28±3.37）×10-3cm／min，差异有统计学意义（P＜0.01）。模型对125I-牛血清白蛋白具有良好的限制通透作用。第二部分脑内β淀粉样蛋白1-40经血脑屏障体外模型的外流转运目的：检测脑微血管内皮细胞株上LRP-1的表达，并观察LRP-1与脑侧β淀粉样蛋白1-40经BBB体外模型外流转运的关系。方法：RT-PCR和Western Blot法检测共培养7d的HUVEC、单独培养的第2代HUVEC、小鼠脑微血管内皮细胞株bEnd.3和人第3代As LRP-1 mRNA及蛋白水平的表达。分别在0min、10min、20min、30min、60min和120min 6个时间点观察外源性Aβ1-40（50nmol／L）经BBB体外模型（HUVEC／As共培养）的转运，以及As侧加RAP（200nmol／L）或抗LRP-1抗体（60ug/ml）预孵和HUVEC侧加入凝溶胶蛋白（9ug／ml）对Aβ1-40经BBB体外模型转运的影响。ELISA法检测各组转运实验后培养液中Aβ1-40的浓度。结果：共培养、单独培养的第2代HUVEC和bEnd.3均有LRP-1mRNA的表达。单独培养的As无LRP-1 mRNA的表达。共培养与单独培养的第2代HUVEC均存在LRP-1蛋白水平的表达。共培养和单独培养的As均无LRP-1蛋白水平的表达。Western blot的结果与RT-PCR结果一致。随转运时间延长，As侧Aβ1-40浓度逐步降低，20min时由（200.12±15.01）pg／ml降低到（99.07±11.92）pg/ml。2h后浓度为（44.92±7.40）pg/ml。RAP预处理后，各时间点As侧Aβ1-40浓度与对照组的差异有显著性（P＜0.05）。LRP-1预处理后，各时间点As侧Aβ1-40浓度与对照组的差异有显著性（P＜0．05），与RAP组的差异无显著性（P＞0.05）。凝溶胶蛋白组各时间点As侧Aβ1-40浓度与对照组的差异有显著性（P＜0.05）。Aβ1-40经BBB的外流转运不影响BBB的屏障功能。第三部9-LRP-1与小鼠脑内β淀粉样蛋白1-40外流转运的体内实验目的：通过体内实验观察LRP-1与小鼠脑内Aβ1-40外流转运的关系。方法：RAP、抗LRP-1抗体或生理盐水脑内注射（RAP 5umol／L；抗LRP-1抗体60ug／ml；生理盐水）。每点0.3ul。隔天1次，共2w。分别于注射前、第8d、第15d取血浆与脑匀浆，ELISA法测定Aβ1-40含量。凝溶胶蛋白（0.6mg／kg体重／d，隔天1次，共3w）和等量生理盐水腹腔注射。分别于注射前、第12d、第22d取血浆与脑匀浆，ELISA法测定Aβ1-40含量。空白对照组：在相应时间点血浆与脑匀浆（注射前、第8d、第15d），ELISA法测定小鼠血浆及脑匀浆Aβ1-40含量。结果：抗LRP-1抗体脑内注射后，dO、d8和d15脑匀浆Aβ1-40水平分别为（47.29±6.80）pg/g组织、（69.03±9.06）pg/g组织、（86.63±7.78）pg/g组织，差异有显著性（P＜0.05）。并且d0、d8和d15脑匀浆Aβ1-40水平与生理盐水脑内注射组或空白对照组的差异均有统计学意义（P＜0.05）。LRP-1脑内注射后，dO、d8和d15血浆Aβ1-40水平分别为（14.67±3.37）pg/ml、（8.59±1.32）pg/ml、（4.56±0.89）pg/ml。组间差异有显著性。并且d0、d8和d15血浆Aβ1-40水平与生理盐水脑内注射组或空白对照组的差异均有统计学意义（P＜0.05）。RAP脑内注射后，dO、d8和d15脑匀浆Aβ1-40水平分别为（40.38±7.93）pg/g组织、（57.86±8.85）pg/g组织、（74.73±8.54）pg/g组织。脑匀浆Aβ1-40水平与生理盐水脑内注射组或空白对照组的差异均有统计学意义（P＜0.05），与LRP-1组的差异无统计学意义（P＞0.05）。RAP脑内注射后，d0、d8和d15血浆Aβ1-40水平分别为（16.21±2.71）pg／ml、（7.56±0.85）pg/ml、（5.26±1.65）pg/ml。血浆Aβ1-40水平与生理盐水脑内注射组或空白对照组的差异均有统计学意义（P＜0.05），与LRP-1组的差异无统计学意义（P＞0.05）。凝溶胶蛋白腹腔注射后，d0、d12和d22脑匀浆Aβ1-40水平分别为（45.33±7.63）pg/g组织、（32.28±4.24）pg/g组织、（24.17±3.73）pg/g组织。脑匀浆Aβ1-40水平与生理盐水腹腔注射组或空白对照组的差异均有统计学意义（P＜0.05）。凝溶胶蛋白腹腔注射后，dO、d12和d22血浆Aβ1-40水平分别为（13.18±2.03）pg/ml、（23.60±3.35）pg/ml、（28.93±3.57）pg/ml。血浆Aβ1-40水平与生理盐水腹腔注射组或空白对照组的差异均有统计学意义（P＜0.05）。空白对照组、生理盐水脑内注射组和生理盐水腹腔注射组d0、d8（12）以及d15（22）脑匀浆Aβ1-40水平的差异均无统计学意义（P＞0.05）。空白对照组、生理盐水脑内注射组和生理盐水腹腔注射组内以及组内d0、d8（12）和d15（22）血浆Aβ1-40水平的差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论1．HUVEC与小鼠As共培养建立的BBB体外模型能较好模拟在体BBB类似的结构与屏障功能。HUVEC的原代培养相对简单，容易达到共培养对细胞纯度的要求。培养液中加入氢化可的松后，HUVEC增殖迅速，节省构建模型所需要的时间，同时加入激素也有助于BBB体外模型的生物学特性的维持。2．通过RT-PCR和Western Blot方法检测到脑微血管内皮细胞株上LRP-1的表达。50 nmol／L外源性Aβ1-40经BBB体外模型外流转运的半衰期在20min左右。而此浓度与3～4月龄β淀粉样前体蛋白转基因小鼠脑内Aβ1-40浓度相当，由此提示，生理状态下BBB具有强大的清除脑内Aβ1-40的能力。抗LRP-1抗体能够抑制Aβ1-40的外流转运，RAP同样能抑制脑侧高浓度Aβ1-40的外流转运，其抑制能力与抗LRP-1抗体相当。外周使用凝溶胶蛋白促进脑侧外源性Aβ1-40的外流转运。3．小鼠脑内注射抗LRP-1抗体后，脑内Aβ1-40负荷增加，同时出现血浆Aβ1-40浓度的降低，提示脑内注射抗LRP-1抗体能够抑制脑内Aβ1-40的外流转运。脑内注射RAP后，脑内Aβ1-40负荷增加，同时出现血浆Aβ1-40浓度的降低，提示脑内注射RAP能够抑制脑内Aβ1-40的外流转运，并且其抑制的程度与抗LRP-1抗体脑内注射相当。外周使用Aβ1-40吸附剂（凝溶胶蛋白）后，脑内Aβ1-40负荷降低，同时出现血浆Aβ1-40浓度的升高，提示腹腔注射凝溶胶蛋白能够促进脑内Aβ1-40的外流转运。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 血脑屏障体外模型的建立与评价
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 1-40经血脑屏障体外模型的外流转运'>第二部分 脑内β淀粉样蛋白_1-40经血脑屏障体外模型的外流转运
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 1-40外流转运的体内实验'>第三部分 LRP-1与小鼠脑内β淀粉样蛋白_1-40外流转运的体内实验
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 全文小结
• 创新点
• 不足之处
• 综述
• 致谢
• 发表论文