COPD大鼠气道成纤维细胞转染rHSG基因后观察细胞增殖、凋亡及与TGF-β1、PDGF表达水平关系

论文摘要

目的：本研究通过构建携带增殖抑制基因（rHSG）的真核表达载体,转染至慢性阻塞性肺疾病（COPD）大鼠气道成纤维细胞,观察COPD大鼠气道成纤维细胞增殖、凋亡及转化生长因子（TGF-β1）、血小板衍生长因子（PDGF）表达水平关系,为干预气道成纤维细胞增殖引起肺部疾病如慢性阻塞性肺疾病,打下基因治疗基础,并为寻找到延缓COPD病情进展提供了理论依据。方法：采用SD雄性大鼠构建COPD大鼠模型,运用组织块贴壁法,体外培养COPD大鼠气道原代成纤维细胞,并用波形蛋白鉴定细胞,取3代细胞进行后续实验。通过分子克隆,构建携带rHSG基因的真核表达载体,实验分组为：对照组（COPD模型未转染组）、空载体pEGFP-nl组、转染pEGFP-rHSG组,实验将阳离子脂质体作为转染介质,把重组质粒转染到COPD模型大鼠气道成纤维细胞,分别感染24小时、48小时、3天、5天、7天后,使用MTT方法检测转染后成纤维细胞增殖凋亡情况；Western blot检测转染后rHSG、TGF-β1、PDGF蛋白含量；提取总RNA,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测TGF-β1、PDGF及rHSGmRNA的表达水平。对数据进行统计学分析,应用SPSS18.0软件,得到实验数据用x±s表示,采用单因素方差分析均数、标准差,P<0.05为有显著性统计学意义。结果：COPD大鼠气道成纤维细胞原代培养成功,经过免疫组化,波形蛋白鉴定呈阳性。随着rHSG基因转染大鼠气道成纤维细胞时间延长,rHSG基因转染组明显比模型对照组对成纤维细胞的增殖有抑制作用；TGF-β1、PDGF两个基因的mRNA表达量减少出现在转染24小时,其mRNA的表达量减少值达到了最大在7天的时侯,在5天-7天时候mRNA表达量也有减少,但是幅度较前减小各转染组间TGF-β1、PDGFmRNA表达量差别,满足P<0.05。当pEGFP-rHSG转染到细胞24小时,rHSGmRNA表达量开始增加,增加值达到最大在7天的时侯,而转染5d-7d时表达仍有继续增加,但增加幅度较前面明显,各转染组间rHSG mRNA表达差别满足P<0.05。结论：rHSG基因与TGF-β1、PDGF基因的平衡关系被打破,是COPD气道重塑中至关因素。rHSG基因转染组随着感染时间延长明显够抑制COPD气道成纤维细胞增殖,相反COPD气道成纤维细胞中TGF-β1与PDGF随着rHSG基因感染时间延长出现低表达,证实当外源性rHSG基因转染到COPD大鼠气道成纤维细胞,能够调节TGF-β1、PDGF基因的过度表达,进而使气道成纤维细胞的增殖受到抑制。因此高效率的rHSG基因转染有可能会在一定程度上延缓COPD气道重塑进展。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 COPD大鼠模型构建及气道成纤维细胞原代培养
• 1
• 1.1 主要试剂与仪器
• 1.2 常用试剂配置
• 2.构建COPD大鼠模型
• 2.1 实验动物
• 2.2 实验分组
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 COPD模型大鼠造模方法及鉴定
• 2.3.2 组织标本采集及原代培养方法
• 2.3.3 细胞传代培养
• 2.3.4 细胞冻存
• 2.3.5 细胞复苏
• 2.3.6 成纤维细胞的纯化
• 2.3.7 成纤维细胞的鉴定
• 3 实验观测指标
• 4 结果
• 4.1 COPD大鼠造模鉴定结果
• 4.2 COPD大鼠和正常大鼠气道成纤维细胞原代培养鉴定结果
• 4.3 成纤维细胞纯化及波形蛋白鉴定
• 第二部分：重组大鼠质粒pEGFP-rHSG/Mfn2的构建及体外转染对COPD大鼠气道成纤维细胞增值影响
• 一、重组大鼠质粒pEGFP-rHSG/Mfn2的构建
• 1.材料与仪器
• 2 实验方法
• 2.1 从大鼠气道成纤维细胞细胞中抽提总RNA
• 2.2 RNA反转录成cDNA
• 2.3 引物设计
• 2.4 基因的PCR扩增
• 2.5 目的片段的与目的载体的连接
• 2.7 抽提质粒
• 2.8 质粒鉴定
• 3 实验结果
• 二、体外转染对COPD大鼠气道成纤维细胞增值影响
• 1 稀释脂质体转染成纤维细胞
• 2 血球计数板计数
• 3 MTT转染不同时间细胞生长增殖能力测定
• 4 Western blot法检测转染后各组rHSG、TGF-β1、PDGF蛋白表达情况
• 5 RT-PCR检测rHSG、TGF-β1、PDGFmRNA的表达
• 6 统计学处理数据
• 7 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录一 缩略语表
• 附录二 综述
• 参考文献
• 附录三 致谢
• 附录四 个人简介