国内禽戊型肝炎病毒的分离鉴定及其抗原性的研究

论文摘要

禽戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus,HEV）是鸡的大肝大脾（Big liver and spleen disease,BLS）病或肝炎脾大（Hepatitis-Splenomegaly,HS）综合症的主要病原,主要引起30-72周龄的蛋鸡和肉种鸡的死淘率升高和产蛋率下降（20-40%）,发病鸡通常腹部充血,卵巢退化,肝脏脂肪或淀粉样变性,偶有肝脾肿大。该病曾给澳大利亚的养禽业造成了严重的经济损失,而我国也时有该病爆发的报道。禽HEV与人、猪HEV同属于肝炎病毒属,为无囊膜,单股正链RNA病毒,其基因组全长约为6.6kb,比哺乳动物HEV基因组全长少600bp左右,包含5’帽子和3’PolyA结构,含有3个开放阅读框（Open reading frame,ORF）,分别为ORF1、ORF2和ORF3。其中ORF2基因编码衣壳蛋白是病毒的主要结构蛋白,并且包含病毒主要的抗原表位。由于禽HEV没有合适有效的体外培养系统,因此对该病毒的研究大多主要集中在病毒的亚单位蛋白ORF2上,通过原核或真核表达该蛋白,了解该蛋白的生物学活性和抗原性等,从而为该病毒的诊断和预防等提供材料和理论支持。1.国内禽HEV的RT-PCR检测根据实验室前期的禽HEV的血清学调查结果,我们从山东部分的禽HEV抗体阳性率较高的鸡场,收集患有BLS病或HS综合症病鸡的粪便、胆汁和血清。然后参考国外研究学者设计的禽HEV检测引物,对收集样品中的禽HEV RNA进行RT-PCR检测。结果从山东某肉种鸡场收集的粪便和胆汁样品中检测到禽HEV ORF2部分序列,通过该段序列与国外参考序列的同源性比较发现,与欧洲部分国家的分离株同源性较高。2.国内禽HEV分离株的全基因组序列分析参考GenBank上已知禽HEV的全基因组序列,设计12对引物。利用RT-nest-PCR方法从禽HEV核酸检测阳性的胆汁中,扩增六段相互重叠的禽HEV的基因组片段,然后通过软件拼接获得首个国内禽HEV分离株的全基因组序列,命名为CaHEV。将CaHEV与已知参考的4个禽HEV全基因组序列进行同源性和进化树分析,结果发现CaHEV与欧洲同源性最高,同属于禽HEV基因3型。并且不同禽HEV基因型的ORF2之间,氨基酸同源性达到97%以上,提示禽HEV可能仅存在单一的血清型。3. CaHEV的致病性研究将含有禽HEV的胆汁翅静脉攻毒1周龄的SPF鸡,对病毒进行增殖,然后用GE方法对病毒悬液进行定量。利用定量的CaHEV病毒悬液,通过口腔和翅静脉两种途径分别攻毒15周龄的SPF鸡,每组26只。攻毒后每天收集粪样,每三天收集血清,每周剖杀两只鸡,直到第12周剖杀所有鸡只,收集剖杀鸡只的胆汁,肝脏和脾脏同时观察剖杀鸡只的肝脏和脾脏的肉眼损害以及其病理学变化。通过对收集样品的RT-PCR检测发现,翅静脉攻毒组,攻毒后第3天就能从粪便中检测到病毒,一直持续到攻毒后54天仍能检测到;第6天开始出现病毒血症,约持续到第21天左右;口腔攻毒组,在攻毒后第6天开始粪便排毒,第62天仍然排毒,病毒血症开始出现在第12天,持续到第33天。通过ELISA检测攻毒鸡的禽HEV抗体发现,翅静脉攻毒组,抗体效价迅速达到高峰后就开始消退,而口腔接种组缓慢达到高峰并维持一段时间。另外,两种途径接种均有只2只鸡出现了肝脾肿大和严重的出血坏死,脏器的病理学变化也都符合HS综合症的部分临床症状,实验进一步论证了禽HEV可能是HS综合症的主要病原,但并不是唯一原因。3.禽HEV抗体检测的间接ELISA方法的建立及应用利用大肠杆菌原核表达禽HEV衣壳蛋白C端268个氨基酸,纯化后获得蛋白ORF2-268,将该蛋白作为包被抗原,摸索优化ELISA条件,建立禽HEV血清学诊断的间接ELISA方法。利用该ELISA方法,调查了山东省11个种鸡场的禽HEV感染情况。结果发现11个种鸡场都有过禽HEV的感染,不同鸡场的血清阳性率差异显著。其中有两个鸡场的阳性率达到了77%左右,而在检测的所有1379份血清中,493份阳性,阳性率也达到了35.8%,说明禽HEV的感染在山东省某些种鸡场已经非常严重,而且该病的感染已在全省范围内广泛流行。此外,利用该ELISA方法,跟踪检测了某种鸡场5个不同厂区的不同周龄鸡的禽HEV抗体的阳性率,结果发现,5个厂区都在12周龄左右就检测到了禽HEV抗体,在20-30周龄时,抗体阳性率达到最大,其中某个厂区在40-50周龄时出现了第二个高峰,大于60周龄时,抗体阳性率非常低。结果说明禽HEV在该种鸡场自然状况下的感染通常发生在小于10周龄的鸡,当鸡只达到20-30周龄时,禽HEV感染了鸡场里大多数的鸡,当达到60周龄时,禽HEV抗体已经在大多数鸡中消退。4.禽HEV人工感染鸡后产生的针对不同抗原区的抗体变化规律禽HEV的衣壳蛋白含有病毒主要的抗原表位,并且通过软件分析和前期实验室的研究发现,衣壳蛋白的前半段22-83aa存在着一个主要的抗原区,而在后半段有339-383aa,389-410aa,461-492aa,556-566aa和583-600aa 5个主要的抗原区,另外ORF3蛋白上也存在着抗原表位能够刺激机体产生免疫反应。为了研究这几个抗原区在人工感染鸡中产生的免疫应答情况,我们利用实验室前期表达的不同的截段蛋白ORF2-F（包含22-83aa）,ORF2-S（包含后半段5个主要的抗原区）,ORF2-5（339-442aa,包含后半段前两个抗原区）,ORF2-8（383-515aa,包含后半段第2和第3个抗原区）,ORF2-9（412-546aa,包含第4个抗原区）和ORF3蛋白作为包被抗原,间接ELISA检测了禽HEV感染鸡后不同日龄的血清中针对不同抗原区的抗体变化规律。结果发现针对ORF2-S蛋白的抗体在感染后12天左右就可以检测到,比ORF2-F和ORF3的早约3天左右,但是针对ORF2-F和ORF3的抗体效价迅速达到高峰后（感染后21天左右）就开始消退,而针对ORF2-S的则缓慢达到高峰维持一段时间后,缓慢消退。用ORF2-5作为包被抗原检测的抗体效价变化规律与用ORF2-S的相似,而用ORF2-8作为包被抗原的则测得抗体效价很低,说明人工感染禽HEV的鸡主要产生了针对抗原区339-383aa的抗原应答反应。当用ORF2-9作为包被抗原时,检测不到任何针对该蛋白的抗体,说明人工感染禽HEV的鸡并没有对该区域412-546aa产生免疫应答反应。5.禽HEV病毒样粒子的获得利用杆状病毒真核表达系统,表达了禽HEV衣壳蛋白全长,N端缺失56个氨基酸的ORF2Δ56和C端268个氨基酸的ORF2-268蛋白。通过IFA和Western-blot鉴定发现,三段蛋白都在该系统中成功表达,并且发现ORF2Δ56蛋白表达后分泌到细胞培养上清中。同时将该系统表达的三段蛋白与原核表达的相同氨基酸序列的蛋白分析发现,该系统除了表达获得预期大小的蛋白外,还获得了多个比预期大小小的蛋白,证实了禽HEV衣壳蛋白在该系统中表达可能被细胞内的酶酶解成小的片段。另外,通过对分泌到细胞上清中的ORF2Δ56蛋白蔗糖密度梯度离心纯化,负染透射电镜观察,发现禽HEV衣壳蛋白的片段ORF2Δ56蛋白在sf9昆虫细胞中表达后可以自我组装成病毒样粒子。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 戊型肝炎病毒的研究进展
• 1.1.1 戊型肝炎病毒的研究概况
• 1.1.2 戊型肝炎病毒的分类
• 1.1.3 戊型肝炎病毒的形态特征和理化特性
• 1.1.4 戊型肝炎病毒的基因组结构
• 1.1.5 编码的蛋白
• 1.1.6 戊型肝炎病毒基因分型的多样性
• 1.1.7 基因分型与地理分布的关系
• 1.1.8 戊型肝炎病毒的复制
• 1.1.9 戊型肝炎病毒的宿主
• 1.1.10 戊型肝炎病毒的传播途径
• 1.1.11 戊型肝炎的流行情况
• 1.1.11.1 人类中HEV 感染流行
• 1.1.11.2 动物中HEV 感染流行
• 1.1.12 戊型肝炎病毒的致病性和临床表现
• 1.1.13 戊型肝炎病毒的检测方法
• 1.1.14 戊型肝炎病毒疫苗的研制
• 1.2 禽戊型肝炎病毒的研究进展
• 1.2.1 禽戊型肝炎病毒的研就概况
• 1.2.2 禽戊型肝炎病毒的历史概述
• 1.2.3 禽戊型肝炎病毒的病原特性和基因组结构
• 1.2.4 禽戊型肝炎病毒的流行病学的研究概况
• 1.2.5 禽戊型肝炎病毒的传播
• 1.2.6 禽戊型肝炎病毒的致病性
• 1.2.7 禽戊型肝炎病毒鸡体内的复制位点
• 1.2.8 禽戊型肝炎病毒的免疫学研究概况
• 1.2.9 禽戊型肝炎病毒的人畜共患性
• 1.3 本研究的目的与意义
• 2 我国鸡群禽HEV 的RT-PCR 检测
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.1.1 菌株和载体
• 2.1.1.2 分子生物学试剂及试剂盒
• 2.1.1.3 主要仪器
• 2.1.1.4 试验所用溶液及其配制
• 2.1.1.5 RT-PCR 相关物品的处理
• 2.1.1.6 样品来源
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 引物设计
• 2.1.2.2 样品的RNA 提取
• 2.1.2.3 提取总RNA 的纯度检测
• 2.1.2.4 禽HEV 基因的RT-PCR 检测
• 2.1.2.5 基因扩增产物的回收与纯化
• 2.1.2.6 回收产物与T 载体的连接
• 2.1.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.1.2.8 连接产物的转化
• 2.1.2.9 质粒DNA 的提取
• 2.1.2.10 质粒DNA 的酶切鉴定
• 2.1.2.11 序列测定
• 2.1.2.12 序列分析
• 2.2 结果
• 2.2.1 部分鸡临床症状
• 2.2.2 样品检测结果
• 2.2.3 构建的克隆质粒的酶切鉴定
• 2.2.4 目的片段的克隆测序
• 2.2.5 获得的序列与已知禽HEV 的同源性分析
• 2.2.6 获得的序列与GenBank 上的参考序列进化树分析
• 2.3 讨论
• 3 国内禽HEV 分离株的全基因组序列分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.1.1 主要试剂和试剂盒
• 3.1.1.2 主要仪器
• 3.1.1.3 样品
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 胆汁样品总RNA 的提取
• 3.1.2.2 引物的设计
• 3.1.2.3 禽HEV 全基因组不同片段的RT-PCR 扩增
• 3.1.2.4 利用3’RACE 技术扩增禽HEV 全基因组的3’端
• 3.1.2.5 利用5’RACE 试剂盒扩增禽HEV 全基因组的5’端
• 3.1.2.6 凝胶回收扩增的不同片段的PCR 产物
• 3.1.2.7 回收的PCR 产物连接与转化
• 3.1.2.8 质粒提取
• 3.1.2.9 质粒DNA 的酶切鉴定
• 3.1.2.10 重组质粒的序列测定
• 3.1.2.11 国内禽HEV 全基因组的序列分析
• 3.2 结果
• 3.2.1 禽HEV 全基因组不同片段的RT-PCR 扩增
• 3.2.2 克隆质粒的酶切鉴定结果
• 3.2.3 序列拼接结果
• 3.2.4 全基因组序列分析
• 3.2.5 全基因组的3 个开放阅读框与3’PolyA 序列的同源性分析
• 3.2.6 CaHEV 的进化关系
• 3.3 讨论
• 4 国内禽HEV 分离株CaHEV 的致病性研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.1.1 病毒
• 4.1.1.2 实验动物
• 4.1.1.3 分子生物学试剂
• 4.1.1.4 HE 染色试剂的配制
• 4.1.2 方法
• 4.1.2.1 病毒的定量
• 4.1.2.2 病毒的增殖
• 4.1.2.3 动物实验设计
• 4.1.2.4 样品的收集
• 4.1.2.5 RT-PCR 检测不同样品的禽HEV 的RNA
• 4.1.2.6 PCR 产物的克隆测序
• 4.1.2.7 粪便悬液里的病毒粒子的电镜观察
• 4.1.2.8 间接ELISA 检测禽HEV 抗体
• 4.1.2.9 病理切片制备
• 4.2 结果
• 4.2.1 临床症状
• 4.2.2 不同样品的禽HEV RNA 检测结果
• 4.2.3 不同接种途径组的血清中抗体变化规律
• 4.2.4 剖杀鸡只的肉眼损害
• 4.2.5 肝脏脾脏的HE 染色的显微变化
• 4.2.6 粪便悬液中病毒粒子的电镜观察
• 4.2.7 部分样品的PCR 产物的克隆测序和比较
• 4.3 讨论
• 5 禽HEV 抗体检测的间接ELISA 的建立及应用
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.1.1 病毒，质粒和菌种
• 5.1.1.2 主要试剂
• 5.1.1.3 主要仪器
• 5.1.1.4 SDS-PAGE 有关溶液
• 5.1.1.5 Western blot 所需溶液
• 5.1.1.6 Ni-NTA 亲和蛋白纯化所需溶液
• 5.1.1.7 电洗脱纯化蛋白所需溶液
• 5.1.1.8 ELISA 所需溶液
• 5.1.2 方法
• 5.1.2.1 禽HEV 衣壳蛋白结构与功能分析
• 5.1.2.2 引物的设计与合成
• 5.1.2.3 目的基因的获得，测序
• 5.1.2.4 设计带有酶切位点的引物
• 5.1.2.5 目的条带和载体的酶切与回收
• 5.1.2.6 阳性克隆的筛选
• 5.1.2.7 三段重组蛋白的表达和纯化
• 5.1.2.8 间接ELISA 条件的优化
• 5.1.2.9 间接ELISA 的操作程序和结果判定
• 5.1.2.10 间接ELISA 的重复性试验
• 5.1.2.11 间接ELISA 方法的初步应用
• 5.2 结果
• 5.2.1 ProtFun 软件分析禽HEV 衣壳蛋白结果
• 5.2.2 重组表达质粒的鉴定
• 5.2.3 重组质粒的克隆测序
• 5.2.4 三段重组蛋白表达诱导条件的确定
• 5.2.5 三段重组蛋白的Westernblot 鉴定
• 5.2.6 三段蛋白的纯化
• 5.2.7 PET-268 蛋白为包被抗原的间接ELISA 方法的建立
• 5.2.8 间接ELISA 方法的应用
• 5.2.9 不同片段的衣壳蛋白和ORF3 蛋白的抗原性比较
• 5.2.10 人工感染鸡不同日龄血清针对不同抗原产生的抗体变化规律
• 5.3 讨论
• 6 禽HEV 衣壳蛋白昆虫细胞的表达及其病毒样粒子的获得
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.1.1 菌株和质粒
• 6.1.1.2 细胞、受体菌和细胞培养基
• 6.1.1.3 主要试剂
• 6.1.1.4 培养基及主要试剂的配置方法
• 6.1.1.5 主要仪器
• 6.1.2 方法
• 6.1.2.1 引物的设计与合成
• 6.1.2.2 目的基因测获得
• 6.1.2.3 三段基因的重组转移载体的构建与鉴定
• 6.1.2.4 转移重组质粒的转座
• 6.1.2.5 三个重组Bacmid 转染sf9 昆虫细胞及收获重组杆状病毒
• 6.1.2.6 三段蛋白在昆虫细胞sf9 中表达与检测
• 6.1.2.7 三段蛋白原核表达与昆虫细胞表达的区别
• 6.1.2.8 表达的衣壳蛋白组装成病毒样粒子可能性研究
• 6.2 结果
• 6.2.1 三段基因转移载体的酶切鉴定
• 6.2.2 重组转移载体的克隆测序
• 6.2.3 重组杆粒的鉴定
• 6.2.4 重组杆状病毒感染sf9 细胞后的细胞病变
• 6.2.5 重组蛋白在sf9 细胞中表达的IFA 检测
• 6.2.6 蛋白表达产物的SDS-Page 分析和Western-blotting 鉴定
• 6.2.7 ORF2 全长和ORF2Δ56 蛋白原核表达和sf9 昆虫细胞表达的比较
• 6.2.8 病毒样粒子的检测
• 6.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表论文
• 博士学位论文内容简介及自评