紫花苜蓿和白花草木樨细胞融合技术研究

论文摘要

利用原生质融合进行优良基因转移是一种短期而且非常有效的生物技术。目前国内外利用此项技术对番茄、烟草、水稻等植物进行了大量的研究。现已从许多种内、种间、属间甚至亚科间的体细胞杂交获得杂种细胞系或杂种植株。目前细胞融合技术已被广泛用于牧草研究的许多领域,并在紫花苜蓿和其他牧草抗性育种、减少膨胀病危害、提高干物质消化率、生物可降解材料开发、生物土壤改良、生物疫苗及活性制剂等方面取得了进展和突破。但是利用草木樨进行原生质体融合的研究国内外未见报道。本实验建立了完整的紫花苜蓿、草木樨组培体系,并对紫花苜蓿、白花草木樨原生质体融合的条件进行了初步分析,主要结果如下:1.以MS为基本培养基,通过调整激素浓度等培养条件,摸索出紫花苜蓿和草木樨组织培养体系的最佳培养基。紫花紫花苜蓿的最佳培养基:愈伤组织诱导最佳培养为MS+2,4-D3.0mg-Lˉ1+6-BA0.3mg-Lˉ1;草木樨的最佳培养基:愈伤诱导最佳培养基为MS+2,4-D1.5mg- Lˉ1+6-BA0.3 mg-Lˉ1。2.本研究对酶液最佳配方进行研究,得出分离紫花苜蓿原生质体酶液的组成以2%的纤维素酶、0.2%果胶酶、0.5%离析酶为好,产量可达1.9×107个/g;酶解时间为10h时原生质体的活力最大为60%;分离草木樨原生质体的酶液组成以2%的纤维素酶、0.3%果胶酶、1%离析酶为好,产量可达4.31×107个/g,酶解时间控制在15h时原生质体的火力最大为62.5%。3.用不同浓度的IOA处理白花草木樨原生质体,得到以下结果:以3mmol/ml IOA处理10min,能有效地使白花草木樨原生质体失活。4.用紫外线处理紫花苜蓿原生质原生质体,得到以下结果:以375 uw/cm2辐射量照射60s,能有效的使紫花苜蓿原生质原生质体失活。5.通过PEG诱导原生质体融合,得到紫花苜蓿和草木樨的属间体细胞杂种,最佳融合条件为:PEG（6000）浓度为40%,融合率为12.5%。

论文目录

• 摘要
• SUMMARY
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1 植物细胞融合
• 1.1 植物原生质体的制备
• 1.1.1 植物的选择
• 1.1.2 制备原生质体的材料选择
• 1.1.3 植物原生质体的酶解
• 1.1.4 植物原生质体的纯化
• 1.1.5 植物原生质体产量和活力鉴定
• 1.2 原生质体的融合技术
• 1.2.1 仙台病毒（HVJ）诱导法
• 1.2.2 PEG-高pH、高钙法诱导融合法
• 1.2.3 植物原生质体电场诱导融合法
• 1.2.4 激光诱导法
• 1.2.5 基于微流控芯片的细胞融合技术
• 1.2.6 高通量细胞融合芯片
• 1.2.7 空间细胞融合技术
• 1.2.8 离子束细胞融合技术
• 1.3 植物杂种细胞筛选鉴定
• 1.3.1 植物杂种细胞筛选
• 1.3.2 植物杂种细胞鉴定
• 1.4 植物原生质体的培养
• 1.4.1 原生质体培养基
• 1.4.2 原生质体培养方法
• 1.4.3 细胞分裂和愈伤组织的形成
• 1.4.4 植株再生
• 第二章 草木樨再生体系原生质体的构建
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.3.1 不同激素浓度组合对草木樨愈伤组织的诱导
• 2.3.2 6-BA 的浓度与愈伤组织诱导的关系
• 2.4 草木樨原生质体的制备
• 2.4.1 材料与方法
• 2.4.2 方法
• 2.4.3 结果
• 第三章 紫花苜蓿再生体系原生质体的构建
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 方法
• 3.3 结果
• 3.4 紫花苜蓿原生质体的制备
• 3.4.1 材料和方法
• 3.4.2 方法
• 3.4.3 结果
• 第四章 原生质体融合
• 4.1 引言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 方法
• 4.3 结果
• 4.3.1 IOA 预处理白花草木樨原生质体分裂的影响
• 4.3.2 紫外线处理紫花紫花苜蓿存活和分裂的影响
• 4.3.3 PEG 浓度对细胞融合的影响
• 4.3.4 融合后原生质体的培养和杂种细胞的鉴定
• 第五章 分析与讨论
• 5.1 激素的浓度配比对愈伤组织诱导具有显著影响
• 5.2 酶液的浓度配比和酶解时间影响着原生质体的产量和活力
• 5.3 PEG 在细胞融合中的影响
• 5.4 原生质体的钝化简化了杂种细胞的筛选
• 5.5 杂种细胞的获得
• 第六章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 导师简介