论文摘要
重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis,SAP）的死亡率很高,急性期常发生急性肺损伤（acute lung injury,ALI）和严重的毛细血管渗漏综合征（capillary leakage syndrome,CLS）,出现严重肺水肿、胸腔积液,导致早期死亡的病人多原于急性呼吸道衰竭（acute respiratory failures,ARF）。虽然目前对各种原因导致的ALI已经有广泛而深入的研究,但是SAP急性期肺损伤后肺毛细血管渗漏机制和肺水肿渗漏的途径并没有一个明确而系统的阐述。迄今应对SAP急性期并发ALI后产生的肺水肿的主要措施就是应用呼吸机机械通气支持等方案,但在临床诊疗过程中发现治疗效果常常并不理想。近期已有大量文献报道,骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stem cells,BMSCs）能促进ALI后损伤肺组织的修复,改善肺功能状况。本课题以重症急性胰腺炎肺损伤大鼠模型为研究对象,研究SAP导致肺水肿的肺毛细血管渗漏机制,并通过静脉移植同种异体BMSCs对SAP肺损伤大鼠模型进行治疗,观察BMSCs对肺毛细血管渗漏的治疗效果,同时对BMSCs移植治疗高渗漏性肺水肿的可能作用机制进行分析。第一部分重症急性胰腺炎动物模型的制作目的：探讨建立稳定可靠、具有明显ALI表现的SAP动物模型的方法,为后续SAP肺损伤渗漏机制的研究提供可重复性好的SAP动物模型。方法：健康雄性SD大鼠随机分成实验组（SAP）、对照组（Control-AP）.假手术组（SO）。经胆胰管逆行注射5%牛磺胆酸钠,SAP组给予结扎胆胰管远端,Control-AP组不结扎胆胰管,SO组仅翻动胰腺,术后补液支持。分别在3hr,6hr, 12hr,24hr不同时间点观察各组动物模型的生命征、腹水量变化及血清和腹水中淀粉酶等生化指标变化,对胰腺的破坏程度进行评分,以评价模型的严重程度。结果：SAP组大鼠12hr后出现大量腹水,24hr后生存率急剧下降,表现为呼吸短促,濒死前口鼻呼出淡红色血性泡沫痰,12hr血淀粉酶达峰值（6650.90±1157.85 IU/L）明显高于Control-AP组（4431.30±599.68 IU/L）和SO组（831.10±93.26 IU/L）（p<0.001）；SAP组24hr胰腺组织病理显示腺叶结构消失,脂肪细胞空泡化,间质微血管破裂,从胰腺病理学评分看出SAP组胰腺病变严重程度随造模后时间延长而加重,并且比同期Control-AP组大鼠胰腺破坏更明显（p<0.001）。结论：本模型制作方法简单可靠,成功率高；能充分复制临床SAP临床表现、呼吸系统并发症及胰腺组织损害病理结果,适合作为SAP早期干预性研究的实验动物模型。第二部分重症急性胰腺炎动物模型肺损伤及渗漏的特点目的：利用SAP实验动物模型,对该方法制作的大鼠SAP模型的肺损伤严重程度进行评价,对肺水肿渗漏特点进行分析,判断该实验动物模型是否适合用于研究SAP肺损伤及肺水肿渗漏机制。方法：健康雄性SD大鼠随机分成实验组（SAP）、假手术组（SO）,逆行注射5%牛磺胆酸钠制作大鼠SAP模型。每组观察四个时间点3hr,6hr,12hr,24hr,分别观察各组模型动物呼吸系统表现、肺湿/干重比,利用Evan’s Blue作为示踪剂观察肺毛细血管的渗漏程度以及在光镜下和扫描电镜下观察肺组织损伤情况。结果：SAP组大鼠出现烦躁不安、呼吸短促、反应迟缓、体温冰冷、呼吸短促困难以、胸腔积液及呼出淡红色血性泡沫痰,并逐渐死亡,具有显著呼吸衰竭的表现。Evan’s Blue检测肺毛细血管通透性发现SAP组肺毛细血管通透性随病程时间延长明显增高（p<0.05）。通过组织病理可以发现肺组织严重的炎症、水肿、出血、渗出,大部分肺泡萎陷、肺不张,肺病理评分明显高于SO组,并随模型时间呈逐渐加重（p<0.001）。在电镜观察下SAP组肺毛细血管基膜溶解,毛细血管内皮细胞损伤,紧密连接破坏,甚至胞膜溶解破裂；肺上皮细胞之间连接增宽；细胞出现核变性、溶解,线粒体空泡化等细胞凋亡表现。结论：该模型能在SAP早期出现明显的肺水肿、ALI或ARDS表现；肺组织细胞结构发生严重不可逆病理损害,肺毛细血管内皮-肺泡上皮双重屏障的密闭性受损,因此该模型可以用于SAP肺损伤渗漏机制的研究及SAP肺损伤早期干预性研究。第三部分重症急性胰腺炎肺毛细血管渗漏机制的研究目的：通过SAP大鼠模型,观察SAP急性期肺毛细血管内物质通透肺毛细血管内皮屏障和肺泡上皮屏障,漏至肺间质、肺泡腔甚至胸膜腔的途径,阐明SAP肺毛细血管的渗漏机制。方法：健康雄性SD大鼠随机分成实验组（SAP）、假手术组（SO）,逆行注射5%牛磺胆酸钠制作大鼠SAP模型。每组观察四个时间点3hr,6hr,12hr,24hr,分别观察各组动物肺组织AQP1、AQP5和MMP9的变化,以及观察肺脏层胸膜的病理改变；以及用硝酸镧作为示踪剂,观察SAP肺毛细血管内皮屏障和肺泡上皮屏障功能状态。结果：通过硝酸镧示踪电镜细胞化学法发现,SAP肺损伤3hr前肺毛细血管内皮细胞之间的紧密连接破坏并不严重,6hr后毛细血管内皮细胞紧密连接破坏,间隙增宽,24hr后不但紧密连接破坏、间隙增宽,而且毛细血管内皮细胞膜破裂,在内皮细胞中出现裂隙,同时肺上皮细胞屏障的完整性也遭受破坏；在扫描电镜下观察肺脏层胸膜发现,SAP肺损伤12hr后肺胸膜出现纤维结构断裂,开始出现细小孔洞状损害,通透性增高,24hr后肺脏层胸膜呈筛漏状,结构完整性和密闭性严重受损；通过免疫荧光组织化学和Western Blotting方法发现,与SO组相比,SAP肺损伤大鼠肺组织AQP1, AQP5蛋白表达在3hr前无明显变化（分别p=0.731,p=0.620）,但6hr后表达明显减少p<0.05)；MMP9蛋白表达从3hr开始就呈逐渐增加趋势p<0.001)；通过实时荧光定量PCR分析发现,SAP肺损伤大鼠肺组织AQP1mRNA在3hr前表达出现短暂增加现象（p=0.044）,而AQP5mRNA在3hr前表达无明显变化p=0.147),但6hr后两者表达均逐渐下降p<0.001)；MMP9 mRNA的表达水平3hr开始即明显升高,12hr时达峰值水平,24hr后开始下降（p<0.05）。结论：SAP炎性损伤早期导致肺毛细血管内皮细胞及肺泡上皮细胞的紧密连接破坏,细胞之间间隙增宽,MMP9大量表达,基膜溶解,连续性中断,肺毛细血管通透性增高,是早期肺毛细血管渗漏的机制；后期肺组织细胞间隙逐渐增宽,出现毛细血管内皮细胞膜损伤破裂,在细胞内形成裂隙通道,甚至肺脏层胸膜纤维结构断裂、出现筛漏状孔洞,肺内皮屏障-上皮屏障的完整性完全丧失,是后期导致严重ALI和ARDS时肺毛细血管渗漏的机制。同时,因AQP1和AQP5表达水平下降,导致AQP1和AQP5对肺内水分子跨膜转运效率下降,肺泡及间质水肿液不能及时被清除,是SAP肺毛细血管渗漏后引起肺损伤、肺水肿程度加重的机制之一。第四部分大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定目的：建立简便快捷的实验室分离纯化BMSCs的方法,为下一步SAP肺毛细血管渗漏的干预性治疗研究提供可靠的移植材料。方法：无菌条件下取幼龄雄性SD大鼠股骨和胫骨,剪开骨干骺端,1%青链霉素-10%FBS/L-DMEM缓慢冲洗骨髓腔,重悬细胞后以5×107/ml细胞浓度接种于细胞培养瓶,5%CO2培养箱培养。观察细胞生长、增殖情况,原代培养按1：2传代扩增,并对P3代细胞进行流式细胞仪CD29+、CD90+、CD34-、CD45细胞免疫表型鉴定,以及细胞免疫组化CD29+、CD44+表型鉴定,分析BMSCs纯度。结果：P5代之前的BMSCs在体外培养过程中保持着较强的增殖活力及稳定的细胞学特性。流式细胞仪鉴定结果显示,P3代BMSCs表型CD29+ CD90+ CD34-CD45-细胞群占总体细胞比例达98%以上。免疫细胞化学染色显示P3代细胞CD44+ CD29+表型呈阳性的BMSCs细胞数占98%以上。鉴定表明细胞符合BMSCs细胞表面抗原特征,P3代BMSCs纯度较高,适用于细胞移植。结论：本研究通过全骨髓贴壁培养、差异性贴壁法分离纯化培养的BMSCs具有典型的细胞形态,符合BMSCs细胞表面抗原特征；获得BMSCs的方法简便易行；获得的细胞生物性能稳定,细胞纯度高,增殖活性强。可以作为下一步SAP肺毛细血管渗漏治疗性研究的种子细胞来源。第五部分同种异体骨髓间充质干细胞移植对大鼠重症急性胰腺炎模型肺毛细血管渗漏的治疗效果评价目的：通过SAP大鼠模型,观察同种异体骨髓间充质干细胞移植对大鼠SAP模型肺毛细血管渗漏的影响,对其治疗效果进行评价,并分析可能的作用机制。方法：健康雄性SD大鼠,逆行注射5%牛磺胆酸钠制作大鼠SAP模型。随机分成随机分成对照组（Control-SAP）、BMSCs治疗组（BMSCs-SAP）、甲氢泼尼松琥珀酸钠治疗组（MP-SAP）,每组观察2个时间点6hr,12hr。分别观察各组动物血清淀粉酶、白蛋白及IL-1、TNF-α水平,肺湿/干重比,胰腺和肺组织病理改变,肺组织AQP1、AQP5和MMP9的表达变化,肺脏层胸膜的病理改变,以及用硝酸镧作为示踪剂观察SAP肺毛细血管内皮屏障和肺泡上皮屏障功能状态。结果：BMSCs治疗组与Control-SAP组相比,大鼠呼吸较平稳,无粉红色泡沫痰等症状出现,腹水减少,肺湿/干重比降低（p<0.001）,生存率明显提高；血清淀粉酶、IL-1β和TNF-α水平明显下降（p<0.001）,并呈逐渐降低趋势；胰腺和肺组织病理学损害均减轻,病理评分降低（p<0.001）；肺毛细血管内皮细胞之间紧密连接破坏明显减轻,未见内皮破裂现象,肺毛细血管内皮屏障完整性保持相对比较完好,肺上皮细胞之间的紧密连接也未见明显破坏,肺泡上皮屏障功能状态良好；肺脏层胸膜结构完整。但是各观察指标好转程度要劣于MP-SAP组。模型6hr时肺组织中MMP9蛋白表达量在三组之间无差别（p=0.787）,但12hr后BMSCs-SAP组低于Control-SAP组、高于MP-SAP组（p=0.001）；AQP1和AQP5在6hr时表达量在三组间无明显差别（p=0.247；p=0.629）,12hr后BMSCs-SAP组高于Control-SAP组、低于MP-SAP组（p<0.05）。结论：同种异体骨髓间充质干细胞移植,通过抑制IL-1β、TNF-α等炎症介质,阻断炎症反应的信号通路,抑制MMP9的表达,减轻炎症因子对肺毛细血管内皮细胞、毛细血管外基膜及上皮细胞的损伤,保护肺毛细血管内皮屏障和肺泡上皮屏障的完整性,同时减少对AQP1和AQP5表达的破坏作用,提高肺间质和肺泡内水肿液的转运效率,对大鼠重症急性胰腺炎模型肺毛细血管渗漏具有明显的治疗作用。虽然甲氢泼尼松琥珀酸钠在SAP急性期治疗中的短期效果比BMSCs移植治疗效果明显,但是在SAP转归期,对于受损细胞的替代、组织结构修复以及器官功能转归方面,BMSCs移植治疗可能更有优势。全文小结通过SAP大鼠肺损伤模型发现,肺毛细血管内皮细胞及肺泡上皮细胞紧密连接破坏,细胞间隙增宽,基膜溶解中断,血管内液体及小分子物质外渗,是肺毛细血管早期渗漏的机制；随病程发展,肺组织细胞间隙逐渐增宽,并且毛细血管内皮细胞膜出现破裂,在细胞内形成裂隙通道,肺内皮屏障-上皮屏障的密封性完全丧失,甚至肺脏层胸膜纤维结构断裂、出现筛漏状孔洞,血管内物质大量外漏,导致严重ALI和ARDS,是肺毛细血管后期渗漏的机制。同时AQP1和AQP5表达水平下降导致肺内水肿液清除转运效率下降,是SAP肺毛细血管渗漏后导致肺损伤、肺水肿程度加重的机制之一。用同种异体骨髓间充质干细胞移植治疗后,BMSCs通过抑制IL-1β、TNF-a等炎症介质,阻断炎症反应的信号通路,减轻炎症因子对肺毛细血管内皮细胞、毛细血管外基膜及上皮细胞的损伤,保护肺毛细血管内皮屏障和肺泡上皮屏障的完整性,同时减少对AQP1和AQP5表达的破坏作用,提高肺间质和肺泡内水肿液的转运效率,BMSCs对大鼠重症急性胰腺炎模型肺毛细血管渗漏具有明显的治疗和预防作用。