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Acinetobacter sp. SM04降解玉米赤霉烯酮的研究

2020-12-11阅读(737)

Acinetobacter sp. SM04降解玉米赤霉烯酮的研究

论文摘要

玉米赤霉烯酮（Zearalenone, ZEN）是镰刀属真菌产生的,具有类雌激素毒性的一类真菌毒素。它能导致家禽家畜和人等发生雌激素过多症而造成生殖系统紊乱。ZEN污染的饲料能给农场动物养殖带来的巨大的经济损失,研究一种经济有效的ZEN污染饲料的脱毒技术将是非常必要的。本文以从农作物耕种土壤中分离出的一株能有效降解ZEN的细菌菌株为研究对象,采用蛋白质分离纯化技术分离纯化了菌株内与ZEN降解相关的酶,系统的研究了这些酶降解ZEN的特性,并使其应用在ZEN污染饲料的脱毒上。通过富集培养的方法,成功的从农业土壤中分离到一株能以ZEN为唯一碳源和能源生长的细菌菌株,标记为SM04。16s rDNA序列分析表明菌株SM04与不动杆菌属（Acinetobacter）菌株有99.5%的相似性。比较了菌株在不同液体培养基中培养期间降解ZEN的能力差异。当菌株SM04培养在营养比较丰富的培养基（如营养肉汤）时,其液体培养物不具有降解ZEN的能力。而培养在营养相对简单的培养基（如M1培养基）时,其液体培养物具有高效降解ZEN的能力。M1培养基的配方如下:15 g乙酸钠,3 g NH4NO3, 1.5 g K2HPO4·3H2O,1 g KCl,0.5 g MgSO4·7H2O, 0.1 g CaCl2和10 ml的微量元素储备液（2 g/l FeSO4·7H2O, 0.4 g/l MnSO4·4H2O, 0.4 g/l CuSO4·5H2O,0.4 g/l CoCl6·6H2O和0.5 g/l ZnCl2）,混合后,加去离子水定容到1000 ml （pH为7.3左右）;研究了不同培养时间的菌株SM04的M1培养物上清液降解ZEN的能力。结果表明,菌株SM04的M1培养物上清液具有降解ZEN能力,其中对数培养期末的M1培养物上清液降解ZEN的能力最强。研究了低氧气含量,蛋白酶,SDS,和EDTA对M1培养物上清液降解ZEN的能力的影响,结果表明它们都能明显抑制M1培养物上清液降解ZEN的能力,因此我们推断M1培养物上清液应该存在一些金属离子依赖的氧化酶类参与了ZEN的氧化降解。此外,也研究了温度对M1培养物上清液降解ZEN的能力的影响,结果表明80℃处理1h后,M1培养物上清液还残留有60%的ZEN降解能力。ZEN是一种类雌激素,在体外具有促进MCF-7细胞（人乳腺癌细胞）增殖作用。采用MCF-7细胞增殖测试证明M1培养物上清液能将ZEN氧化降解成为了一种低雌激素活性的代谢物。实验证明,M1培养物上清液降解ZEN后的产物中有微量的过氧化氢产生。采用乙酸乙酯萃取M1培养物上清液降解ZEN后的产物,采用HPLC-二极光阵列紫外可见光检测器分析,结果发现有两个中间产物ZEN-1和ZEN-2生成。M1培养物上清液在真空旋转蒸发仪低温（50℃）浓缩8倍后,采用Sephadex G-50柱对菌株SM04的M1培养物上清液中存在的与ZEN氧化降解相关的酶类进行了初步分离,获得了一个能有效氧化降解ZEN的ZEN氧化酶组分。低氧气含量,蛋白酶,SDS,和EDTA能明显抑制ZEN氧化酶组分降解ZEN的能力。采用MCF-7细胞增殖测试证明ZEN氧化酶组分也能将ZEN氧化降解成为了一种低雌激素活性的代谢物。与M1培养物上清液降解ZEN的产物不同,ZEN氧化酶组分降解ZEN后的产物中有大量的过氧化氢产生,检测出有两个新产物Ox-1和Ox-2生成,而没有中间产物ZEN-1和ZEN-2生成。此外,通过SDS-PAGE和MALDI-TOF-TOF/MS技术分析鉴定了ZEN氧化酶组分中的酶蛋白,鉴定结果表明在ZEN氧化酶组分中,主要含有血红素依赖的细胞色素类加氧酶。M1培养物上清液在真空旋转蒸发仪低温（50℃）浓缩8倍后,采用Sephadex G-50柱和DEAE Sephadex A-50柱纯化,从菌株M1培养物上清液中获得了一个thiol-redoxin过氧化物酶组分。该thiol-redoxin过氧化物酶组分在碱性条件能表现出很强的过氧化物酶活性,同时还能催化H2O2氧化降解ZEN、Ox-1和Ox-2,且生成的代谢物不具有雌激素活性。菌株SM04 thiol-redoxin过氧化物酶降解ZEN的最适pH和最适温度分别为9.0和70℃。此外,用乙酸乙酯萃取Acinetobacter sp. SM04 thiol-redoxin过氧化物酶降解ZEN产物后,用HPLC-二极光阵列紫外可见光检测器分析发现有三个明显的产物峰出现,三个产物在230-260 nm之间无强烈的紫外吸收,而在300 nm左右有一个强的光吸收峰。我们推断ZEN在被Acinetobacter sp. SM04 thiol-redoxin过氧化物酶氧化降解后,ZEN中的苯环很可能发生氧化断裂。基于SDS-PAGE和MALDI-TOF-TOF/MS技术分析获得地菌株SM04 thiol-redoxin过氧化物酶蛋白的部分氨基酸序列,我们成功的扩增了该酶蛋白的基因序列,通过NCBI Blast Search程序,发现该酶蛋白属于硫氧还蛋白过氧化物酶家族（peroxiredoxin）,完全不同于目前大量应用的血红素依赖的过化物酶（如辣根过氧化物酶,木质素过氧化物酶等）。使用T4 DNA连接酶将双酶切（NdeI和XhoI）并纯化后的Acinetobacter sp. SM04中thiol-redoxin过氧化物酶基因的开放阅读框连接到同样双酶切并纯化的pET-31 b（+）载体中,成功构建了Acinetobacter sp. SM04中thiol-redoxin过氧化物酶基因的表达载体。含有Acinetobacter sp. SM04中thiol-redoxin过氧化物酶基因的表达载体转化到感受态的E. coli BL21 （DE3）中,使Acinetobacter sp. SM04中thiol-redoxin过氧化物酶基因在大肠杆菌中大量表达。重组的thiol-redoxin过氧化物酶也具有很强的过氧化物酶活力,并且也具有催化H2O2氧化降解ZEN的能力。以ZEN污染严重的玉米酒精糟（dried distillers’grains and solubles, DDGS）为研究对象,模拟测试了M1培养物上清液和重组的thiol-redoxin过氧化物酶降解玉米酒精糟中ZEN的能力。实验结果表明,M1培养物上清液和重组的thiol-redoxin过氧化物酶都具有高效降解玉米酒精糟中ZEN的能力。同时采用正交实验,分析了影响M1培养物上清液和重组的thiol-redoxin过氧化物酶降解玉米酒精糟中ZEN的因素主要为作用时间、温度、H2O2浓度、和DDGS样品与酶溶液质量比。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 缩略语表
  • 第一章 绪论
  • 1.1 玉米赤霉烯酮
  • 1.1.1 概述
  • 1.1.2 ZEN 的化学特性和检测
  • 1.1.3 ZEN 在动物体内的代谢和对动物的毒性
  • 1.1.4 我国食品和饲料中ZEN 的限量标准
  • 1.1.5 控制食品和饲料中ZEN 危害的具体措施
  • 1.2 不动杆菌属（Acinetobacter ）细菌概述
  • 1.2.1 自然分布
  • 1.2.2 分类鉴定和生理生化特性
  • 1.2.3 医学临床意义
  • 1.2.4 生态环境意义
  • 1.3 生物质谱法分析鉴定蛋白质技术概述
  • 1.3.1 生物质谱技术的原理和类型
  • 1.3.2 质谱法对蛋白质或多肽序列分析及鉴定的原理
  • 1.4 本研究的意义和主要内容
  • 1.4.1 研究意义
  • 1.4.2 研究目标
  • 1.4.3 研究内容
  • 第二章 玉米赤霉烯酮降解菌Acinetobacter sp. SM04 的分离和鉴定
  • 2.1 引言
  • 2.2 材料和方法
  • 2.2.1 化学试剂
  • 2.2.2 培养基
  • 2.2.3 土壤样品
  • 2.2.4 主要仪器
  • 2.2.5 Acinetobacter sp. SM04 的分离
  • 2.2.6 Acinetobacter sp. SM04 分类鉴定
  • 2.2.7 Acinetobacter sp. SM04 液体培养物降解ZEN 的研究
  • 2.2.8 Acinetobacter sp. SM04 液体培养物中ZEN 的萃取方法
  • 2.2.9 液体培养物上清液降解ZEN 的研究
  • 2.2.10 影响液体培养物上清液降解ZEN 效率的因素研究
  • 2.2.11 ZEN 降解能力测试方法
  • 2.2.12 高效液相色谱（HPLC）分析检测ZEN 的条件
  • 2.2.13 过氧化氢浓度的测定
  • 2.2.14 Acinetobacter sp. SM04 的M1 培养物上清液降解ZEN 的产物分析
  • 2.2.15 MCF-7 乳腺癌细胞增殖测试
  • 2.3 结果与讨论
  • 2.3.1 降解ZEN 菌株的分离和鉴定
  • 2.3.2 Acinetobacter sp. SM04 液体培养物降解ZEN 的研究
  • 2.3.3 Acinetobacter sp. SM04 的M1 液体培养物上清液降解ZEN 的研究
  • 2.3.4 影响Acinetobacter sp. SM04 的M1 培养物上清液降解ZEN 效率的因素研究
  • 2.3.5 Acinetobacter sp. SM04 的M1 培养物上清液降解ZEN 的产物分析
  • 2.4 本章小结
  • 第三章 Acinetobacter sp. SM04 液体培养物中ZEN 氧化酶组分的纯化和产物分析
  • 3.1 引言
  • 3.2 材料和方法
  • 3.2.1 化学试剂
  • 3.2.2 主要仪器
  • 3.2.3 Acinetobacter sp. SM04 的M1 培养物上清液中ZEN 氧化酶组分的纯化
  • 3.2.4 ZEN 降解活力测试方法
  • 3.2.5 血红素含量和蛋白质浓度分析
  • 3.2.6 过氧化氢浓度的测定
  • 3.2.7 ZEN 氧化酶组分的产物分析
  • 3.2.8 ZEN 氧化酶组分降解产物对MCF-7 细胞增殖率测试
  • 3.2.9 ZEN 氧化酶组分中蛋白的 SDS-PAGE 和 MALDI-TOF-TOF/MS 分析和鉴定
  • 3.3 结果和分析
  • 3.3.1 Acinetobacter sp. SM04 的M1 培养物上清液中ZEN 氧化酶组分的纯化
  • 3.3.2 ZEN 氧化酶组分降解ZEN 的特性分析
  • 3.3.3 ZEN 氧化酶组分的产物对MCF-7 细胞增殖率测试
  • 3.3.4 ZEN 氧化酶组分的产物分析
  • 3.3.5 ZEN 氧化酶组分中酶蛋白特性分析
  • 3.4 本章小结
  • 第四章 Acinetobacter sp. SM04 的M1 培养物上清液中thiol-redoxin 过氧化物酶的纯化和特性研究
  • 4.1 引言
  • 4.2 材料和方法
  • 4.2.1 化学试剂
  • 4.2.2 主要仪器
  • 4.2.3 Acinetobacter sp. SM04 的M1 培养物上清液中thiol-redoxin 过氧化物酶的纯化
  • 4.2.4 过氧化物酶活力测试方法
  • 4.2.5 抑制剂对Acinetobacter sp. SM04 中thiol-redoxin 过氧化物酶活力的影响
  • 4.2.6 酶蛋白的SDS-PAGE 和MALDI-TOF-TOF/MS 分析和鉴定
  • 4.2.7 血红素含量分析
  • 4.2.8 酶蛋白的凝胶渗透高效色谱分析
  • 4.2.9 Acinetobacter sp. SM04 中thiol-redoxin 过氧化物酶降解ZEN 或其代谢物的能力
  • 4.2.10 Acinetobacter sp. SM04 中thiol-redoxin 过氧化物酶基因的克隆
  • 4.3 结果和分析
  • 4.3.1 Acinetobacter sp. SM04 的M1 培养物上清液中thiol-redoxin 过氧化物酶的纯化
  • 4.3.2 Acinetobacter sp. SM04 中thiol-redoxin 过氧化物酶的酶学特性研究
  • 4.3.3 Acinetobacter sp. SM04 中thiol-redoxin 过氧化物酶的血红素含量分析
  • 4.3.4 抑制剂对Acinetobacter sp. SM04 中thiol-redoxin 过氧化物酶活力的影响
  • 4.3.5 Acinetobacter sp. SM04 中thiol-redoxin 过氧化物酶降解ZEN 或其代谢物的能力
  • 4.3.6 Acinetobacter sp. SM04 中thiol-redoxin 过氧化物酶蛋白的SDS-PAGE 和 MALDI-TOF-TOF/MS 分析和鉴定
  • 4.3.7 Acinetobacter sp. SM04 中thiol-redoxin 过氧化物酶蛋白的基因和推导的氨基酸序列
  • 4.4 结论
  • 第五章 Acinetobacter sp. SM04 中thiol-redoxin 过氧化物酶降解ZEN 的特性和产物初步分析
  • 5.1 引言
  • 5.2 材料和方法
  • 5.2.1 化学试剂
  • 5.2.2 主要仪器
  • 5.2.3 Acinetobacter sp. SM04 的M1 培养物上清液中thiol-redoxin 过氧化物酶的纯化
  • 202 浓度对Acinetobacter sp. SM04 中thiol-redoxin 过氧化物酶氧化降解ZEN 的影响'>5.2.4 H202 浓度对Acinetobacter sp. SM04 中thiol-redoxin 过氧化物酶氧化降解ZEN 的影响
  • 5.2.5 Acinetobacter sp. SM04 中thiol-redoxin 过氧化物酶降解ZEN 的测试方法
  • 5.2.6 Acinetobacter sp. SM04 中thiol-redoxin 过氧化物酶降解ZEN 的产物分析
  • 5.2.7 Acinetobacter sp. SM04 中thiol-redoxin 过氧化物酶降解ZEN 的产物对 MCF-7 细胞增殖率测试
  • 5.3 结果和分析
  • 5.3.1 Acinetobacter sp. SM04 中thiol-redoxin 过氧化物酶降解ZEN 的特性
  • 5.3.2 Acinetobacter sp. SM04 中thiol-redoxin 过氧化物酶降解ZEN 的产物对MCF-7 细胞增殖率测试
  • 5.3.3 Acinetobacter sp. SM04 中thiol-redoxin 过氧化物酶组分的产物分析
  • 5.4 本章小结
  • 第六章 Acinetobacter sp. SM04 中thiol-redoxin 过氧化物酶基因在大肠杆菌中的表达和它重组蛋白的特性
  • 6.1 引言
  • 6.2 材料和方法
  • 6.2.1 化学试剂
  • 6.2.2 主要仪器
  • 6.2.3 Acinetobacter sp. SM04 中thiol-redoxin 过氧化物酶原核表达质粒的构建
  • 6.2.4 重组的Acinetobacter sp. SM04 中thiol-redoxin 过氧化物酶在E. coli BL21（DE3）中的表达和纯化
  • 6.2.5 过氧化物酶活力测试方法
  • 6.2.6 Acinetobacter sp. SM04 中thiol-redoxin 过氧化物酶降解ZEN 的测试方法
  • 6.2.7 血红素含量和蛋白质浓度测定
  • 6.3 结果和分析
  • 6.3.1 Acinetobacter sp. SM04 中thiol-redoxin 过氧化物酶的重组，表达和纯化X
  • 6.3.2 重组的thiol-redoxin 过氧化物酶的过氧化物酶学特性研究
  • 6.3.3 重组的thiol-redoxin 过氧化物酶降解ZEN 的特性
  • 6.4 本章小结
  • 第七章 Acinetobacter sp. SM04 的M1 培养物上清液和重组thio-redoxin 过氧化物酶降解玉米酒精糟中ZEN 的研究
  • 7.1 引言
  • 7.2 材料和方法
  • 7.2.1 化学试剂
  • 7.2.2 培养基
  • 7.2.3 DDGS 样品
  • 7.2.4 主要仪器
  • 7.2.5 Acinetobacter sp. SM04 的M1 培养物上清液的制备
  • 7.2.6 Acinetobacter sp. SM04 的M1 培养物上清液降解玉米酒精糟中ZEN 的实验设计
  • 7.2.7 重组Acinetobacter sp. SM04 中thiol-redoxin 过氧化物酶液的制备
  • 7.2.8 重组Acinetobacter sp. SM04 中thiol-redoxin 过氧化物酶液降解玉米酒精糟中ZEN 的实验设计
  • 7.2.9 高效液相色谱（HPLC）分析检测ZEN 的条件
  • 7.3 结果和分析
  • 7.3.1 Acinetobacter sp. SM04 的M1 培养物上清液降解玉米酒精糟中ZEN 的研究
  • 7.3.2 重组Acinetobacter sp. SM04 中thiol-redoxin 过氧化物酶降解玉米酒精糟中ZEN 的研究
  • 7.4 本章小结
  • 结论与展望
  • 1.结论
  • 2.本论文的主要创新点
  • 3.展望
  • 附录
  • 参考文献
  • 攻读博士学位期间取得的研究成果
  • 致谢
  • 附件

    • 相关论文文献

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