抗刚地弓形虫特异性人源抗体Fab片段的制备和研究

论文摘要

刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）简称弓形虫,属于顶复门、真球虫目、弓形虫科,是一种世界性分布的专性细胞内寄生的机会性致病原虫,可寄生于多种脊椎动物的体内。免疫缺损者感染弓形虫后,可导致严重的全身性弓形虫病。可通过母体垂直感染胎儿出现先天性弓形虫病。大量的实验证明在弓形虫感染过程中,机体产生的抗体具有重要的保护性作用。为此本研究旨在制备出抗弓形虫的人源抗体,为弓形虫病的被动免疫防治策略的发展和应用提供理论和实验依据。首先利用基因重组技术构建弓形虫速殖子表面蛋白SAG1的表达质粒,通过原核表达系统进行大量的表达,并纯化制备出具有生物活性的重组SAG1,作为抗体库筛选抗原。分离弓形虫病患者的外周血淋巴细胞,利用工程抗体技术构建出库容为3×10的人抗弓形虫免疫球蛋白G基因文库。采用克隆印迹法、ELISA、间接免疫荧光反应（IFA）等多种方法以重组蛋白对抗体库进行较大规模的筛选验证,对所得阳性克隆进行测序和结构分析。经过6×105个克隆的筛选,最后得到两个阳性克隆,分别命名为Tox08、Toxll。Tox08和Toxll的重链可变区近似系同为VH3-23,基因同源性分别为98%和98.26%。Tox08的轻链可变区近似系为VK1-33、基因同源性为87.46%；Toxll的轻链可变区近似系为Vκ1-27、基因同源性为93.43%。根据Kabat系统对可变区的划分,Toxll的轻链可变区部分缺少互补决定区1（CDR1）,完全缺失CDR2和框架区FR2。为了提高抗体的亲和力,分别对Tox08的轻重链和Toxll的轻链进行链替换,构建链替换库。经筛选后,从Toxll的重链与弓形虫病患者来源的轻链库构建的Toxll轻链替换库ToxllH-Toxlib中筛选出两个阳性克隆,分别命名为Tox87L-11H和Tox1403L-11H。Tox87L-11H和Tox1403L-11H的轻链可变区近似系同为VK：I-17,基因同源性分别为92.11%和89.61%。对阳性克隆Tox1403L-11H进行大量表达,并分别采用抗体亲和层析、钴离子亲和层析和镍离子亲和层析三种纯化方法对其进行纯化。根据纯化后的Fab片段的产量、轻重链比例以及与rSAG1的亲和力评定纯化方法的优劣。经抗体亲和层析和镍离子亲和层析得到的Fab片段的轻重链比例为1：1,产量分别为0.75mg/L和1.08mg/L。钴离子亲和层析纯化的Fab片段产量虽然高于另两种方法,为1.16mg/L,但轻重链的比例为1：2。Biacore检测分析表明,镍离子亲和层析提纯的Fab片段与rSAG1的亲和力最高,其结合常数为9.0×1071/M,解离常数为2.01×10-8M。上述研究工作不仅制备出具有抗弓形虫特异性的人源抗体Fab片段,还同时确立了其纯化方法,为抗弓形虫特异性的人源抗体工厂化生产和临床研究应用提供了理论和实验依据。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 刚地弓形虫表面蛋白的重组与表达
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分 构建人抗刚地弓形虫免疫球蛋白G基因文库
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第三部分 抗体库的筛选
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第四部分 抗体的优化
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第五部分 重组抗体的大量表达和纯化
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 论文总结
• 参考文献
• 附录
• 综述
• 参考文献
• 致谢