Kupffer细胞介导乳化异氟醚预处理对大鼠肝缺血再灌注损伤保护作用机制的实验研究

论文摘要

第一部分Kupffer细胞介导乳化异氟醚预处理对大鼠肝缺血再灌注损伤保护作用的在体实验研究目的探讨乳化异氟醚预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用,并且证明这一作用由Kupffer细胞介导。方法将SD大鼠制成肝脏缺血再灌注损伤模型,随机分为脂肪乳剂对照组（C组）、Kupffer细胞阻断对照组（KC组）、乳化异氟醚预处理组（IP组）和Kupffer细胞阻断后乳化异氟醚预处理组（IK组）,观察肝脏缺血30min再灌注2h后血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、肝细胞匀浆丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和肝组织病理学改变。结果与C组相比,IP组肝脏缺血再灌注后血清ALT和AST含量显著降低,肝细胞匀浆MDA含量减少,SOD含量增加,肝组织病理学损害明显减轻:而KC组和IK组与C组相比肝脏缺血再灌注后血清ALT和AST含量,肝细胞匀浆MDA、SOD含量,肝组织病理学损害均无明显变化,即Kupffer细胞阻断后,乳化异氟醚的保护作用被逆转。结论乳化异氟醚预处理对大鼠肝缺血再灌注损伤有保护作用,并且这一作用由Kupffer细胞介导第二部分依赖于NO水平的Kupffer细胞介导乳化异氟醚预处理对大鼠肝缺血再灌注损伤保护作用的在体实验研究目的探讨乳化异氟醚预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用,并且观察这一作用与Kupffer细胞及NO水平的关系。方法将SD大鼠制成肝脏缺血再灌注损伤模型,随机分为脂肪乳剂对照组（C组）、Kupffer细胞阻断对照组（KC组）、乳化异氟醚预处理组（IP组）、Kupffer细胞阻断后乳化异氟醚预处理组（IK组）、NOS激活后乳化异氟醚预处理组（LA组,n=8）和NOS阻断后乳化异氟醚预处理组（LN组,n=8）,观察肝脏缺血30min再灌注2h后血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、肝细胞匀浆丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和肝组织病理学改变,并做肝组织匀浆iNOS的western blot检测。结果与C组相比,IP组肝脏缺血再灌注后血清ALT和AST含量显著降低,肝细胞匀浆MDA含量减少,SOD含量增加,NO和iNOS含量增加,肝组织病理学损害明显减轻;而KC组、IK组、LA组和LN组与C组相比肝脏缺血再灌注后血清ALT和AST含量,肝细胞匀浆MDA、SOD含量,肝组织病理学损害均无明显变化;LA组缺血再灌注后肝细胞匀浆NO和iNOS水平明显增加;LN组缺血再灌注后肝细胞匀浆NO和iNOS水平明显降低;肝脏iNOS表达的western blot检测显示IP组、LA组iNOS表达较高,C组、KC组、IK组iNOS少量表达,而LN组几乎无iNOS表达。结论Kupffer细胞直接介导了乳化异氟醚预处理对大鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用,其作用机制可能与NO和iNOS水平有关。第三部分原代Kupffer细胞介导乳化异氟醚预处理对大鼠肝缺血再灌注损伤的离体实验研究目的建立稳定而有效的大鼠肝脏Kupffer细胞分离、纯化的实验方法,通过离体实验研究探讨乳化异氟醚预处理对原代Kupffer细胞的氧化应激和凋亡的影响,验证乳化异氟醚对大鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用。方法分离、纯化并鉴定大鼠肝脏原代Kupffer细胞,将原代培养的Kupffer细胞随机分为溶媒对照组（Control,不加任何药物）、H2O2模型组（H2O2组,终浓度500μmol/L H2O2处理12小时）、不同浓度的乳化异氟醚预处理组（0.2%IP组、0.1%IP组、0.05%IP组,终浓度分别为0.2%、0.1%和0.05%的乳化异氟醚预处理6小时,然后加入终浓度500μmol/L H2O2处理12小时）,每组至少3孔。ROS荧光法检测细胞内氧化应激活性氧（ROS）含量,流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡情况。结果与H2O2组相比,0.2%IP组、0.1%IP组、0.05%IP组荧光水平都明显较低,ROS含量较低;与H2O2组相比,0.2%IP组和0.1%IP组凋亡细胞数量明显减少（P＜0.05）。结论乳化异氟醚预处理减少原代Kupffer细胞的氧化应激并抑制Kupffer细胞凋亡,可能与乳化异氟醚对大鼠肝血再灌注损伤的保护作用有关。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 前言
• 第一部分 Kupffer细胞介导乳化异氟醚预处理对大鼠肝缺血再灌注损伤保护作用的在体实验研究
• 一、材料与方法
• （一） 实验材料
• 1、实验动物
• 2、主要药品及仪器
• （二） 实验方法
• 1、研究对象
• 2、乳化异氟醚配制
• 3、大鼠肝缺血再灌注损伤模型的制作
• 4、标本采集及检测方法
• 5、统计学处理
• 二、结果
• （一） 血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）变化
• （二） 肝细胞匀浆丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）变化
• （三） 肝组织病理学改变
• 三、讨论
• 第二部分 依赖于NO水平的Kupffer细胞介导乳化异氟醚预处理对大鼠肝缺血再灌注损伤保护作用的在体实验研究
• 一、材料与方法
• （一） 实验材料
• 1、实验动物
• 2、主要药品及仪器
• 3、主要试剂及溶液的配制
• （二） 实验方法
• 1、动物实验的分组
• 2、乳化异氟醚配制
• 3、大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型的制作
• 4、标本采集及检测方法
• 5、肝组织iNOS的免疫印迹检测（western blot）
• 6、统计学处理
• 二、结果
• （一） 血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）变化
• （二） 肝组织匀浆丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）变化
• （三） 肝组织匀浆一氧化氮（NO）和诱生型一氧化氮合酶（iNOS）变化
• （四） 肝脏iNOS表达的western blot检测
• （五） 肝组织病理学改变
• 三、讨论
• 第三部分 原代Kupffer细胞介导乳化异氟醚预处理对大鼠肝缺血再灌注损伤的离体实验研究
• 一、材料与方法
• （一） 实验材料
• 1、主要溶液的配制
• 2、主要实验仪器
• （二） 实验方法
• 1、实验动物
• 2、Kupffer细胞分离、纯化方法
• （1） 肝脏的灌注及消化
• （2） Kupffer细胞的分离、纯化
• 3、Kupffer细胞光镜下观察
• 4、Kupffer细胞鉴定:DAB染色实验
• 5、H2O2致Kupffer细胞过氧化损伤模型的制备和乳化异氟醚预处理
• 6、ROS荧光法检测细胞内氧化应激活性氧（ROS）含量
• 7、流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡
• 8、统计学处理
• 二、结果
• （一） Kupffer细胞光镜下观察结果
• （二） DAB染色实验Kupffer细胞鉴定结果
• （三） 各组Kupffer细胞内氧化应激活性氧（ROS）含量
• （四） 流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡结果
• 三、讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 综述 异氟醚对器官缺血再灌注损伤保护作用机制的研究进展
• 研究生在读期间参与发表的论文目录
• 致谢