关于microRNA沉默SMYD3对乳腺癌MCF-7细胞生物学行为的影响及SMYD3调控c-Myc机理的研究

论文摘要

目的1、构建针对SMYD3（SET and MYND domaineontaining protein3）基因的microRNA真核表达载体,并转染乳腺癌MCF-7细胞检测沉默效果;2、研究沉默SMYD3基因表达对乳腺癌MCF-7细胞生物学特性的影响;3、研究沉默SMYD3基因对乳腺癌MCF-7细胞WNT10B、c-Myc基因表达的影响,探讨其可能的作用机制。方法:1、构建靶向SMYD3的4个microRNA真核表达载体和1个阴性对照载体,稳定转染MCF-7细胞;绿色荧光显微镜及流式细胞仪检测各组细胞绿色荧光蛋白表达率;逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测SMYD3 mRNA表达变化,Westeron blot检测SMYD3蛋白抑制效果。2、二苯基溴化四氮唑蓝（MTT）法描绘细胞生长曲线,平板集落形成实验检测细胞转染前后增殖抑制率;流式细胞仪检测细胞凋亡情况,Matrigel侵袭实验检测细胞体外侵袭能力;3、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测SMYD3、WNT10B及c-Myc mRNA表达变化。结果:1、经测序证明所构建干扰序列正确插入pcDNA6.2-GW/ EmGFPmiR真核表达载体,序列完整。从4个干扰组筛选出mRNA及蛋白表达抑制效果均较好的pcDNA-SMYD3mi-3、pcDNA-SMYD3mi-4作进一步研究。2、MTT结果显示两干扰组细胞生长速度相对明显减慢（P﹤0.05）;两干扰组集落形成率分别为（16.5%）、（18.7%）,与空白组（79.4%）相比显著减少（P<0.05）,阴性对照组（76.6%）和空白组相比无显著差异（P>0.05）;两干扰组早期凋亡率明显增加,分别为（19.3±1.61）%、（17.6±0.45）%,相对阴性对照组（2.1±0.35）%和空白对照组（0.97±0.49）%有显著性差异（P<0.05）;Matrigel侵袭实验结果显示两干扰组穿膜细胞数分别为（7.53±2.00）（9.13±2.50）,与空白组（63.40±6.85）和阴性对照组（66.69±4.63）相比显著减少（P<0.05）,差异有统计学意义; 3、两干扰组mRNA相对表达量分别为: WNT10B （ 0.012±0.001 ）、（ 0.013±0.001 ） , c-Myc（0.054±0.005）、（0.055±0.002）,与阴性及空白对照组相比均明显下调（P﹤0.05）。结论:1、所构建的microRNA真核表达载体能够显著抑制乳腺癌MCF-7细胞SMYD3的mRNA及蛋白的表达,表明构建载体可用于进一步基因功能的研究。2.沉默SMYD3基因可显著抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖,促进细胞的凋亡,抑制细胞的侵袭。3、在乳腺癌中,SMYD3可能通过激活Wnt/β-catenin通路上调WNT10B及c-Myc,实现对细胞增殖、侵袭的促进,同时抑制细胞的凋亡,通过引起细胞上皮间质化引起细胞转移。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 绪论
• 1.1 乳腺癌治疗难点与分子靶向治疗（Targeted Therapy）
• 1.2 癌症发生与表观遗传变异（Epigenetic Variation）
• 1.3 SMYD3 于多种癌症发生、发展中的作用
• 1.3.1 SMYD3 与细胞增殖
• 1.3.2 SMYD3 与侵袭和凋亡
• 1.3.3 SMYD3 与c-Myc 调控
• 1.3.4 SMYD3 自身变异与肿瘤发生
• 1.4 SMYD3 于乳腺癌发生、发展中的作用研究现状
• 2 靶向SMYD3 的microRNA 真核表达载体的构建及其沉默效应检测
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 细胞株
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 常用溶液的配制
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 细胞培养
• 2.2.2 重组质粒的构建
• 2.2.3 脂质体介导的细胞转染
• 2.2.4 RT-PCR 检测各组细胞转染前后SMYD3 mRNA 沉默效果
• 2.2.5 Westeron blot 检测转染前后各组细胞SMYD3 蛋白的沉默效果
• 2.2.6 统计学处理
• 2.3 结果
• 2.3.1 SMYD3 microRNA 的构建
• 2.3.2 稳定转染效率鉴定
• 2.3.3 SMYD3 沉默效果的检测
• 2.4 讨论
• 3 沉默SMYD3 对乳腺癌MCF-7 细胞生物学行为的影响
• 3.1 材料与试剂
• 3.1.1 细胞株
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 常用溶液的配制
• 3.1.4 主要仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 实验分组
• 3.2.2 MTT 法检测稳定转染前后各组细胞的生长情况
• 3.2.3 平板集落形成试验
• 3.2.4 AnnexinV-R-PE/7-AAD 法检测细胞早期凋亡
• 3.2.5 细胞侵袭实验
• 3.2.6 统计学处理
• 3.3 结果
• 3.3.1 细胞增殖的变化
• 3.3.2 细胞凋亡率的分析
• 3.3.3 转染前后MCF-7 各组细胞的体外侵袭能力分析
• 3.4 讨论
• 4 沉默SMYD3 基因对MCF-7 细胞wnt10b、c-myc 表达的影响
• 4.1 材料与试剂
• 4.1.1 细胞株
• 4.1.2 试剂
• 4.1.3 常用溶液的配制
• 4.1.4 主要仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 RNA 提取
• 4.2.2 RNA 逆转录成cDNA
• 4.2.3 PCR
• 4.2.4 琼脂糖凝胶电泳
• 4.2.5 统计学处理
• 4.3 结果
• 4.4 讨论
• 5 参考文献
• 附录A 常用溶液及缓冲液配方
• 附录B 实验设备型号
• 6 在学研究成果
• 7 致谢