类整合素蛋白与微管蛋白在植物响应渗透胁迫中的作用

论文摘要

整合素蛋白是动物细胞粘附分子的重要成员,属于一类跨膜蛋白的超家族,由α-亚基和β-亚基通过非共价键连接而成。它的胞外域能识别并结合各种含有RGD短肽序列的胞外基质分子,而在胞内域连接细胞骨架和信号分子,从而构成了胞外基质-质膜-细胞骨架连续体,成为了动物细胞内外信号转导过程中的关键分子之一,在细胞的运动、增殖、分化和凋亡等方面起着重要的作用。近年来的研究表明:胞外基质-质膜-细胞骨架连续体是所有真核细胞所共有的一种结构,这种结构中的联结分子在植物、真菌和动物细胞中可能是相同或类似的。但对植物细胞内是否存在连接细胞壁组分与细胞骨架的分子,如存在,该类分子的特性又是怎样的还知之甚少。有证据表明在植物细胞的质膜上存在类似动物细胞整合素的蛋白。干旱等逆境引起的渗透胁迫是影响植物生长发育的主要因素之一。阐明植物对渗透胁迫的响应机制,增强植物的抗性具有重要的意义。渗透胁迫导致植物细胞产生质壁分离,而细胞壁与质膜间的粘附结构对于维持植物细胞正常的生理功能至关重要,特别是在对渗透胁迫的反应过程中。作为细胞壁-质膜-细胞骨架连续体的重要分子,质膜上类似于动物细胞整合素蛋白分子以及与细胞骨架间的相互作用很可能参与了渗透胁迫所诱导的许多生理生化响应过程。本试验以拟南芥（Arabidopsis thaliana,Columbia生态型）叶片悬浮培养细胞和玉米（Zea maize L.）幼苗为试验材料,综合利用分子生物学、植物生理学、生物化学和细胞生物学等技术,研究了植物细胞细胞壁与质膜间的相互作用、类整合素和微管蛋白的功能、细胞学定位以及编码类整合素蛋白和微管蛋白基因的克隆与转化,同时研究了类整合素蛋白、细胞骨架及两者的相互作用在渗透胁迫诱导细胞合成ABA中的作用,为进一步深入研究植物细胞壁-质膜-细胞骨架连续体在渗透胁迫信号传导过程中的作用提供一些理论依据。主要结果如下:1、应用差速离心和密度梯度离心分离纯化细胞不同部分（膜部分和可溶性部分）,结合Western Blotting技术分析了相关蛋白的表达。结果表明,在拟南芥悬浮细胞和玉米幼苗根尖细胞的不溶性部分存在与人整合素β1亚基抗体特异反应的蛋白质带,其分子量分别在110kDa和80kDa。用人整合素β1亚基抗体作探针,采用间接免疫荧光定位的方法,在拟南芥悬浮细胞的细胞膜和玉米幼苗根尖细胞

论文目录

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• 中英文对照词
• 第1章 文献综述
• 1.1 整合素（Integrins）
• 1.1.1 整合素蛋白的结构
• 1.1.2 整合素蛋白的活化机制与功能
• 1.1.3 整合素蛋白编码基因的克隆
• 1.2 植物类整合素蛋白的研究进展
• 1.2.1 植物类整合素蛋白的检测
• 1.2.2 植物类整合素蛋白的定位
• 1.2.3 植物类整合素蛋白的功能
• 1.2.4 植物类整合素蛋白的研究展望
• 1.3 植物细胞细胞壁-质膜-细胞骨架连续体及其可能生理功能
• 1.3.1 细胞壁的结构与功能
• 1.3.2 细胞骨架的结构与功能
• 1.3.2.1 细胞骨架的结构
• 1.3.2.1.1 微管的结构
• 1.3.2.1.2 微丝的结构
• 1.3.2.2 细胞骨架的功能
• 1.3.2.2.1 微管的功能
• 1.3.2.2.2 微丝的功能
• 1.3.2.3 植物细胞骨架（主要是微管与微丝）与渗透胁迫应答
• 参考文献
• 第2章 植物类整合素蛋白的检测、定位与功能研究
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 植物材料
• 2.2.2 细胞膜蛋白的提取
• 2.2.3 蛋白质浓度测定及SDS-PAGE
• 2.2.4 Western blotting
• 2.2.5 间接免疫荧光定位
• 2.2.6 拟南芥悬浮细胞原生质体制备
• 2.2.7 试验处理
• 2.2.8 内源ABA 含量的测定
• 2.2.9 光学显微观察
• 2.2.10 拟南芥细胞质壁分离测定方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 拟南芥悬浮细胞和玉米根细胞中类整合素蛋白的免疫印迹分析
• 2.3.2 拟南芥悬浮细胞和玉米根细胞中类整合素蛋白的荧光定位
• 2.3.3 类整合素蛋白参与细胞壁与细胞膜之间的粘连作用的药理学研究
• 2.3.4 原生质体与细胞在渗透胁迫条件下ABA 合成的差异
• 2.4 讨论
• 参考文献
• 第3章 植物类整合素蛋白与α-微管蛋白的荧光共定位及其可能的相互作用研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 植物材料
• 3.2.2 试验处理
• 3.2.2.1 玉米幼苗处理
• 3.2.2.2 拟南芥悬浮细胞处理
• 3.2.3 间接免疫荧光定位
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 玉米根细胞中类整合素蛋白与α-微管蛋白的荧光共定位
• 3.3.2 植物类整合素蛋白与α-微管蛋白可能的相互作用的研究
• 3.3.2.1 类整合素蛋白和微管相关物质对拟南芥悬浮细胞α-微管蛋白的影响
• 3.3.2.2 类整合素蛋白和细胞骨架相关物质对玉米根细胞中类整合素蛋白和α-微管蛋白的影响
• 3.4 讨论
• 参考文献
• 第4章 拟南芥编码类似整合素蛋白基因（At14a）的克隆与表达
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.1.1 植物材料
• 4.2.1.2 质粒与细菌菌株
• 4.2.1.3 化学试剂（盒）
• 4.2.1.4 培养基与主要试剂的配制
• 4.2.1.5 主要仪器
• 4.2.2 方法
• 4.2.2.1 拟南芥编码At14基因的T/A克隆
• 4.2.2.1.1 引物的设计
• 4.2.2.1.2 拟南芥叶片总RNA的提取
• 4.2.2.1.3 第一链cDNA 的合成
• 4.2.2.1.4 At14a 序列的PCR 扩增
• 4.2.2.1.5 PCR 产物的回收
• 4.2.2.1.6 目的片段与克隆载体的连接
• 4.2.2.1.7 大肠杆菌感受态的制备与重组质粒的转化
• 4.2.2.1.8 阳性克隆的筛选
• 4.2.2.1.9 阳性克隆的PCR 鉴定
• 4.2.2.1.10 重组质粒的核苷酸序列测定
• 4.2.2.2 拟南芥编码At14a 基因的TOPO 克隆
• 4.2.2.2.1 引物的设计
• 4.2.2.2.2 拟南芥叶片总RNA 的提取、第一链cDNA 的合成、At14a 序列的PCR 扩增
• 4.2.2.2.3 PCR 产物的克隆
• 4.2.2.2.4 阳性克隆的PCR 鉴定
• 4.2.2.2.5 重组质粒的核苷酸序列测定
• 4.2.2.3 转At14a-GFP 融合基因的双元载体的构建
• 4.2.2.3.1 重组质粒与表达载体质粒的小量提取
• 4.2.2.3.2 转At14a-GFP 融合基因的双元载体的构建
• 4.2.2.3.3 农杆菌阳性克隆的目的基因序列的PCR 鉴定
• 4.2.2.3.4 农杆菌阳性克隆的GFP 基因序列的PCR 鉴定
• 4.2.2.4 At14a-GFP 融合基因的原生质体瞬时表达
• 4.2.2.4.1 玉米根细胞原生质体的分离
• 4.2.2.4.2 At14a-GFP 融合基因的原生质体瞬时表达
• 4.2.2.5 根癌农杆菌介导法培育At14a 基因过表达的转基因拟南芥
• 4.2.2.5.1 野生型拟南芥植株的种植
• 4.2.2.5.2 根癌农杆菌的培养及其介导的拟南芥转化
• 4.2.2.5.3 转At14a-GFP 融合基因拟南芥种子的抗性筛选
• 4.2.2.5.4 转At14a-GFP 融合基因拟南芥中GFP 的组织学定位
• 4.2.2.5.5 转At14a-GFP融合基因拟南芥中总DNA的PCR分析
• 4.2.2.6 转At14a-GFP 基因拟南芥悬浮细胞体系的培育与鉴定
• 4.2.2.6.1 转At14a-GFP 基因拟南芥悬浮细胞体系的培育
• 4.2.2.6.2 转At14a-GFP基因拟南芥悬浮细胞中总DNA的PCR分析
• 4.2.2.6.3 转At14a-GFP 基因拟南芥悬浮细胞中GFP 表达的细胞学定位
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 拟南芥叶片总RNA 的提取
• 4.3.2 拟南芥叶片第一链cDNA 的合成
• 4.3.3 拟南芥At14a 序列的PCR 扩增
• 4.3.3.1 拟南芥At14a 序列TA 克隆的PCR 扩增
• 4.3.3.2 拟南芥At14a 序列TOPO 克隆的PCR 扩增
• 4.3.4 拟南芥At14a 序列的克隆与鉴定
• 4.3.4.1 拟南芥At14a 序列的TA 克隆与鉴定
• 4.3.4.2 拟南芥At14a 序列的TOPO 克隆与鉴定
• 4.3.5 拟南芥编码类似整合素蛋白基因（At14a）的序列分析
• 4.3.5.1 拟南芥At14a 序列的TA 克隆结果的序列分析
• 4.3.5.2 拟南芥At14a 序列的TOPO 克隆结果的序列分析
• 4.3.6 拟南芥编码At14a-GFP 融合基因的构建
• 4.3.7 转At14a-GFP 融合基因的双元载体的农杆菌阳性克隆的鉴定
• 4.3.8 编码At14a-GFP 融合基因的原生质体的瞬时表达
• 4.3.9 转At14a-GFP 融合基因的拟南芥植株的获得与鉴定
• 4.3.10 转At14a-GFP基因拟南芥悬浮细胞中GFP表达的细胞学定位
• 4.4 讨论
• 参考文献
• 第5章 拟南芥编码α-微管蛋白基因（TUA2）的克隆与表达
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 材料
• 5.2.1.1 植物材料
• 5.2.1.2 质粒与细菌菌株
• 5.2.1.3 化学试剂（盒）
• 5.2.1.4 培养基与主要试剂的配制
• 5.2.1.5 主要仪器
• 5.2.2 方法
• 5.2.2.1 拟南芥编码TUA2基因的TOPO克隆
• 5.2.2.1.1 引物的设计
• 5.2.2.1.2 拟南芥叶片总RNA 的提取和第一链cDNA 的合成
• 5.2.2.1.3 TUA2 序列的PCR 扩增
• 5.2.2.1.4 PCR 产物的克隆
• 5.2.2.1.5 阳性克隆的PCR 鉴定
• 5.2.2.1.6 重组质粒的核苷酸序列测定
• 5.2.2.2 转TUA2-GFP 融合基因的双元载体的构建
• 5.2.2.2.1 重组质粒与表达载体质粒的小量提取
• 5.2.2.2.2 转TUA2-GFP 融合基因的双元载体的构建
• 5.2.2.2.3 农杆菌阳性克隆的目的基因序列的PCR 鉴定
• 5.2.2.2.4 农杆菌阳性克隆的GFP 基因序列的PCR 鉴定
• 5.2.2.3 根癌农杆菌介导法培育TUA2 基因过表达的转基因拟南芥
• 5.2.2.3.1 野生型拟南芥植株的种植
• 5.2.2.3.2 根癌农杆菌的培养及其介导的拟南芥转化
• 5.2.2.3.3 转TUA2-GFP 融合基因拟南芥种子的抗性筛选
• 5.2.2.3.4 转TUA2-GFP 融合基因拟南芥中GFP 表达的组织学定位
• 5.2.2.3.5 转TUA2-GFP 融合基因拟南芥中总DNA 的PCR 分析
• 5.2.2.3.6 转TUA2-GFP 融合基因拟南芥的表型分析
• 5.2.2.4 转TUA2-GFP 基因拟南芥悬浮细胞体系的培育与鉴定
• 5.2.2.4.1 转TUA2-GFP 基因拟南芥悬浮细胞体系的培育
• 5.2.2.4.2 转TUA2-GFP基因拟南芥悬浮细胞中总DNA的PCR分析
• 5.2.2.4.3 转TUA2-GFP 基因拟南芥悬浮细胞中GFP 表达的细胞学定位
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 拟南芥叶片总RNA 的提取与拟南芥叶片第一链cDNA 的合成
• 5.3.2 拟南芥TUA2 序列TOPO 克隆的PCR 扩增
• 5.3.3 拟南芥TUA2 序列的TOPO 克隆与鉴定
• 5.3.4 拟南芥编码α-微管蛋白基因（TUA2）的序列分析
• 5.3.5 拟南芥编码TUA2-GFP 融合基因的构建
• 5.3.6 转TUA2-GFP 融合基因的双元载体的农杆菌阳性克隆的鉴定
• 5.3.7 转TUA2-GFP 融合基因的拟南芥植株的获得与鉴定
• 5.3.8 转TUA2-GFP融合基因的拟南芥植株的表型分析
• 5.3.9 转TUA2-GFP 基因拟南芥悬浮细胞中GFP 表达的细胞学定位
• 5.4 讨论
• 第6章 微管在植物响应干旱胁迫中的作用
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 试验材料
• 6.2.2 微管的间接免疫荧光定位
• 6.2.3 内源ABA 含量的测定
• 6.2.4 逆转录PCR 反应（RT-PCR）
• 6.2.4.1 化学试剂（盒）
• 6.2.4.2 引物的设计
• 6.2.4.3 玉米根系总RNA 的提取
• 6.2.4.4 第一链cDNA 的合成
• 6.2.4.5 VP14 序列的PCR 扩增
• 6.2.5 试验处理
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 不同处理玉米根细胞中微管列阵的变化
• 6.3.2 干旱胁迫对玉米根细胞中微管与ABA 含量的影响
• 6.3.3 微管在干旱胁迫诱导玉米根细胞合成ABA 过程中的作用
• 6.4 讨论
• 参考文献
• 第7章 编码类整合素基因（At14α）在拟南芥响应干旱胁迫中的生理功能分析
• 7.1 引言
• 7.2 材料与方法
• 7.2.1 植物材料
• 7.2.2 纯合突变体at14α的鉴定
• 7.2.3 试验处理
• 7.2.4 气孔导度的测定
• 7.2.5 叶片水势的测定
• 7.2.6 土壤含水量的测定
• 7.2.7 叶片内源ABA 含量的测定
• 7.3 结果与分析
• 7.3.1 拟南芥纯合突变体at14α的鉴定
• 7.3.2 三基因型拟南芥响应干旱胁迫的形态学变化
• 7.3.3 干旱处理对三基因型拟南芥叶片气孔导度的影响
• 7.3.4 干旱处理对三基因型拟南芥叶片水势的影响
• 7.3.5 干旱处理对土壤含水量的影响
• 7.3.6 干旱处理对三基因型拟南芥叶片ABA 含量的影响
• 7.4 讨论
• 第8 章总结与讨论
• 附表
• 附表1 拟南芥悬浮细胞培养基配方
• 附录2 玉米幼苗水培培养液配方
• 附表3 植物激素ELISA 操作
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录