松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）flp基因与香蕉穿孔线虫（Radopholus similes）Rs-eng-1基因的克隆和功能分析

论文摘要

FMRF酰胺类多肽（FMRFamide-like peptide,FLP）,是已知的最大和最多样的神经肽家族。FLP介导神经信号传递系统,与寄生线虫的运动和感觉功能密切相关。研究植物寄生线虫FLP,对于了解植物寄生线虫的致病机理,探讨防治植物寄生线虫新途径具有重要意义。β-1,4-葡聚糖酶的主要功能是降解纤维素,引起植物细胞形态和功能上的变化,从而提高线虫在寄主中的寄生能力。编码这些分泌物的基因被看作是寄生基因,克隆这些基因是了解线虫侵染机制的基础。因此,本研究分别从两大外来入侵的植物寄生性线虫松材线虫（Bursaphelenchusxylophilus）和相似穿孔线虫（Radopholus similis）中分离得到FMRF酰胺类多肽基因和葡聚糖酶基因,并进行了较详细的研究,主要研究如下:1.利用生物信息学筛选靶标基因的EST序列,采用RACE法从松材线虫体内获得了9个flp基因的cDNA全长和一个cDNA片段（Bx-flp-3b）,并进行深入分析。这9个flp基因分别是Bx-flp-1,Bx-flp-2,Bx-flp-3a,Bx-flp-6a,Bx-flp-6b,Bx-flp-6c,Bx-flp-6d,Bx-flp-12,Bx-flp-14,其登陆号分别为EU026161,EU930826,EF422867,FJ151415,FJ151416,FJ151417,FJ151418,EF422868,EF622046。从基因结构上分析发现Bx-flp-1由4个外显子和3个内含子组成:Bx-flp-3a由2个外显子和一个内含子组成;Bx-flp-6基因发生两种不同的剪辑方式,剪切方式分别发生在中间和C端,产生了4种不同的选择性剪切异构体。用Tail-PCR的方法分别得到3个基因的5’侧翼序列,大小分别为857bp、377bp和1630bp。2.利用原位杂交的方法将6个flp基因进行定位,发现Bx-flp-1和Bx-flp-3a主要在松材线虫的咽坏和头部表达,Bx-flp-2,Bx-flp-3b,Bx-flp-6a～d,Bx-flp-14主要在松材线虫的尾部表达;而Bx-flp-12的表达模式比较复杂。3.体外合成Bx-flp基因片段的dsRNA,利用浸泡法处理松材线虫,对其进行离体干扰效应验证。QPCR分析表明干扰后的靶标基因Bx-flp-1,Bx-flp-3a,Bx-flp-6转录水平明显降低,只达到对照的22%、41%、29%,达到差异显著（P＜0.05）。显微镜观测干扰后线虫活动能力明显下降,呈现僵直和假死状态。但是,40℃放置1hr后,僵直的线虫又能恢复活动能力。繁殖能力检测发现,干扰松材线虫Bx-flp-1,Bx-flp-3a,Bx-flp-6不能抑制其繁殖。4.用RT-PCR和RACE方法,获得了β-1,4-内切葡聚糖酶基因的cDNA全长,并将该基因命名为Rs-eng-1（GenBank登录号为EU414839）。此cDNA全长序列为1630bp,包括1个1404bp的完整ORF,编码含467个氨基酸的蛋白,其理论分子量与等电点分别为48.22KD,pI为6.04。序列分析表明含有糖基水解酶GHF5的保守结构域,N端具有22个氨基酸残基组成的信号肽,C端含有细菌式样的纤维素结合域（CBDⅡ）。原位杂交结果显示此基因由穿孔线虫的食道腺分泌。Southern分析为多拷贝基因。cDNA与基因组DNA重叠分析表明,此基因包含6个内含子,切割点符合5‘-GT...AG-3’的规律。进化分析表明,与细菌Bacillus subtilis和Erwina carotovora分泌的纤维素酶属于同一支,推测其来源于细菌的水平基因转移。5.分别构建了pET-28（a）-Rs-eng-1,pET-42（a）- Rs-eng-1,pGEX-6P-1-Rs-eng-1原核表达载体,转化大肠杆菌BL21,诱导表达,没有发现特异条带。引入EcoRⅠ和pstⅠ两酶切位点构建表达载体,获得表达菌株pMAL-c2X-Rs-eng-1（BL21）,诱导表达后出现包涵体。因为包涵体没有活性,故重新构建了酵母表达载体pPIC9K-Rs-eng-1,电击转化酵母细胞,利用甲醇诱导,发现Rs-eng-1在酵母中大量表达并分泌到胞外,SDS-PAGE检测表明表达蛋白的表观分子量约为60kD。并且表达的蛋白具有降解纤维素的活性。6.离体RNAi香蕉穿孔线虫Rs-eng-1基因。QPCR检测发现Rs-eng-1基因的mRNA丰度显著下降,其表达量只有对照的15%。纤维素酶活性测定结果显示,经dsRNA处理的线虫纤维素酶分解圈平均值为17cm,而对照为22cm,达到显著差异。繁殖率测定,发现RNAi能抑制香蕉穿孔线虫的繁殖,使其生育滞后。分离RNAi处理后接种的香蕉穿孔线虫,发现雄虫比例上升。7.通过植物介导沉默靶标基因对线虫进行RNAi活体效应研究。将Rs-eng-1基因片段分别正向和反向插入到载体中,构建了目的基因的dsRNA干扰植物表达载体pFGC5941-RSENG-RNAi。采用农杆菌介导法转化番茄,获得了dsRNA干扰表达载体的转基因番茄。对转基因番茄进行PCR扩增检测和Southern分析,证明外源基因已成功整合到植物基因组中,RT-PCR验证外源基因高效表达。将香蕉穿孔线虫接种到T1代植株,45d后发现转基因植株的根系中香蕉穿孔线虫侵染的数目明显少于对照,并且干扰效果优于离体RNAi。将根结线虫2龄幼虫接种到T1代植株,25d后检测根结数,发现表达Rs-eng-1基因dsRNA的番茄根结数明显减少,表明转基因番茄具有高效的抗线虫作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 松材线虫及其危害
• 1.1 分类地位
• 1.2 形态特征
• 1.3 起源与分布
• 1.4 寄主范围及为害症状
• 1.5 防治
• 2 香蕉穿孔线虫及其危害
• 2.1 分类地位
• 2.2 形态特征
• 2.3 分布
• 2.4 侵染及危害
• 2.5 入侵风险
• 2.6 控制与防治
• 3 植物寄生线虫FMRF酰胺类肽研究进展
• 3.1 FMRF酰胺类肽（FMRFamide-related peptides）
• 3.2 植物线虫中FLP肽的多样性
• 3.3 植物寄生线虫FLP功能及其研究方法
• 3.3.1 利用免疫化学方法分析FLP功能
• 3.3.2 利用原位杂交技术分析FLP功能
• 3.3.3 利用基因沉默技术分析FLP功能
• 3.3.4 利用RNAi防治植物线虫
• 3.4 展望
• 4 植物寄生线虫分泌物研究进展
• 4.1 植物寄生线虫的寄生方式
• 4.2 植物寄生线虫分泌器官及其产物
• 4.2.1 植物寄生线虫食道腺细胞
• 4.2.2 食道腺细胞产生的分泌物及其功能
• 4.2.3 侧器及其分泌物
• 4.2.4 表皮及其分泌物
• 4.2.5 直肠腺及其分泌物
• 4.2.6 非蛋白信号
• 4.3 展望
• 5 立题依据与技术路线
• 5.1 立题依据
• 5.2 技术路线
• 第二章 松材线虫FLP基因的克隆
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试线虫培养与分离
• 1.1.2 主要试剂和酶类
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 常用试剂配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 总RNA提取
• 1.2.2 第一链cDNA的合成
• 1.2.3 FLP基因片段的克隆
• 1.2.4 扩增片段的回收,克隆、测序
• 1.2.5 RACE获得全长cDNA
• 1.2.6 3'RACE与5'RACE PCR产物的回收,克隆测序
• 1.2.7 DNA的提取
• 1.2.8 PCR扩增全长基因及内含子检测
• 1.2.9 TAIL-PCR扩增flp基因5'-侧翼序列
• 2 结果与分析
• 2.1 RNA的质量
• 2.2 目的基因片段的扩增
• 2.3 目的基因RACE结果与分析
• 2.4 目的基因cDNA全长序列及预测的氨基酸序列
• 2.5 目的基因内含子检测及5'侧翼序列的获得
• 2.5.1 松材线虫DNA的检测
• 2.5.2 目的基因内含子检测
• 2.5.3 5'侧翼序列的获得
• 3 讨论
• 3.1 利用RACE扩增全长cDNA序列
• 3.2 FMRF酰胺类肽的选择性剪辑
• 3.3 5'-侧翼序列的获得
• 3.3.1 TAIL-PCR
• 3.3.2 松材线虫flp基因5'-侧翼序列
• 第三章 松材线虫FLP基因的表达分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试材料
• 1.1.2 主要试剂和酶类
• 1.1.3 溶液配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 探针合成
• 1.2.2 线虫处理
• 1.2.3 预杂交、杂交
• 1.2.4 洗虫与显色检测
• 2 结果与分析
• 2.1 探针检测
• 2.2 原位杂交结果检测
• 2.2.1 Bx-flp-1的原位杂交结果
• 2.2.2 Bx-flp-2的原位杂交结果
• 2.2.3 Bx-flp-3a的原位杂交结果
• 2.2.4 Bx-flp-3b原位杂交结果
• 2.2.5 Bx-flp-6的原位杂交结果
• 2.2.6 Bx-flp-12的原位杂交结果
• 2.2.7 Bx-flp-14的原位杂交结果
• 3 讨论
• 第四章 松材线虫FLP基因的功能验证
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 FMRF酰胺类肽基因（Bx-flp）的部分片断PCR扩增
• 1.2.2 载体构建
• 1.2.3 质粒提取
• 1.2.4 T7引物PCR扩增及产物纯化
• 1.2.5 体外转录合成dsRNA
• 1.2.6 dsRNA处理线虫
• 1.2.7 QPCR分析
• 1.2.8 RNAi表型分析
• 2 结果与分析
• 2.1 dsRNA的合成
• 2.1.1 Bx-flp片段的PCR扩增
• 2.1.2 合成dsRNA
• 2.2 QPCR结果分析
• 2.2.1 熔点曲线的确定
• 2.2.2 标准曲线的建立
• 2.2.2 RNAi后转录水平分析
• 2.2.3 靶标基因的RNAi表型鉴定
• 3 讨论
• 第五章 香蕉穿孔线虫纤维素酶基因RS-ENG-1克隆及特征分析
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 cDNA的合成
• 1.2.2 目的基因片段的克隆
• 1.2.3 RACE获得全长cDNA
• 1.2.4 Rs-eng-1基因内含子的扩增
• 1.2.5 Rs-eng-1基因的Southern杂交
• 1.2.6 Rs-eng-1基因表达的原位杂交
• 2 结果与分析
• 2.1 RNA的提取
• 2.2 cDNA全长的获得
• 2.3 目的基因的cDNA全长序列及预测的氨基酸序列
• 2.4 目的基因的命名和生物信息学分析
• 2.5 系统发育树的构建
• 2.6 Rs-eng-1基因内含子扩增结果与分析
• 2.6.1 DNA的提取
• 2.6.2 内含子的扩增
• 2.6.3 内含子的比对分析
• 2.7 Rs-eng-1基因的Southern结果与分析
• 2.7.1 DNA的质量及酶切效果检测
• 2.7.2 Southern结果与分析
• 2.7.3 原位杂交结果与分析
• 3 讨论
• 第六章 香蕉穿孔线虫纤维素酶基因RS-ENG-1的原核表达和真核表达
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 Rs-eng-1基因的原核表达
• 1.2.2 Rs-eng-1基因的真核表达
• 2 结果与分析
• 2.1 基因原核表达结果与分析
• 2.1.1 目的片段的鉴定
• 2.1.2 Rs-eng-1基因的原核表达
• 2.2 Rs-eng-1真核表达
• 2.2.1 重组酵母表达载体pPIC9K-Rs-eng-1的构建及鉴定
• 2.2.2 酵母的转化及筛选
• 2.2.3 重组酵母的PCR鉴定
• 2.2.4 表达产物的SDS-PAGE分析
• 2.2.5 表达产物活性分析
• 3 讨论
• 第七章 利用RNAI方法研究香蕉穿孔线虫RS-ENG-1基因功能
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 香蕉穿孔线虫离体RNAi
• 1.2.2 番茄介导的RNA干扰线虫作用
• 2 结果与分析
• 2.1 浸泡体系的建立
• 2.1.1 QPCR检测Rs-eng-1表达量的差异
• 2.1.2 Rs-eng-1 dsRNA对香蕉穿孔线虫体内纤维素酶活性的影响
• 2.1.3 沉默Rs-eng-1后表型鉴定
• 2.1.4 目的基因RNA干扰载体的构建
• 2.1.5 抗生素浓度的筛选
• 2.1.6 转基因番茄的获得
• 2.2 转基因番茄的鉴定
• 2.2.1 转基因植株的Southern检测
• 2.2.2 转基因植株的RT-PCR检测
• 2.2.3 T1代遗传稳定性检测
• 2.2.4 接种香蕉穿孔线虫的抗性检测
• 2.2.5 接种南方根结线虫的抗性检测
• 3 讨论
• 第八章 全文总结
• 参考文献
• 英文缩略表
• 致谢
• 作者简历