人胸腺基质淋巴细胞生成素在母—胎界面的表达及其在母—胎免疫耐受中的调节作用

论文摘要

生理妊娠类似于同种移植,作为同种移植物的胚胎在母体存活直至分娩,实际上反映母体对胚胎的免疫耐受;母体对胚胎的免疫排斥将导致妊娠失败。揭示母-胎免疫耐受的确切机制,对人类自然流产等妊娠疾患的防治具有重要意义;并对移植免疫学和肿瘤免疫学的研究将产生重要的推动作用。母-胎界面主要包括滋养细胞、蜕膜基质细胞、蜕膜腺上皮细胞以及免疫细胞。多年来人们从不同的角度研究母-胎界面发生的生物学事件,以阐述母-胎免疫调节的机制,其中包括母-胎界面Th2型免疫优势的形成,及调节性T细胞（Treg）数量与功能的变化。胸腺基质淋巴细胞生成素（hTSLP）是一种造血细胞因子,诱导炎症局部形成Th2型优势,参与过敏性疾病的发病。不仅如此,正常人胸腺Hassall’s小体分泌hTSLP能激活胸腺树突状细胞（DCs）,从而诱导胸腺CD4+CD8-CD25-T细胞分化为天然CD4+CD25+Foxp3+Treg;母-胎界面结构及细胞组成与胸腺极其类似。母-胎界面是否具有胸腺类似的免疫调节功能,迄今尚不得而知。第一部分hTSLP在人母-胎界面的表达及其调控目的分析人胸腺基质淋巴细胞生成素在母-胎界面的表达特征及其调控。方法收集早孕期正常或不明原因自然流产的绒毛与蜕膜组织,采用RT-PCR、实时定量PCR、免疫组织/细胞化学、Western Blot、ELISA法检测母-胎界面TSLP的表达特征,并比较hTSLP在正常早孕与流产之间的差别。对滋养细胞进行多种干预,包括妊娠相关激素、Th1/Th2型细胞因子及rhTSLP处理,检测其表达TSLP的变化。结果RT-PCR法分析发现,绒毛与蜕膜组织及非孕妇女子宫内膜均转录TSLPmRNA。免疫化学法分析显示,早孕绒毛外层的合体滋养细胞、内层的细胞滋养细胞及侵袭性滋养细胞均表达TSLP。蜕膜腺上皮细胞（DECs）表达TSLP,基质细胞（DSCs）不表达之。1×106cells/ml/孔滋养细胞（Tros）培养至48～72h时,分泌TSLP水平为19.30pg/ml。绒毛与蜕膜组织及培养的原代细胞,正常早孕的TSLP mRNA转录与蛋白表达均明显高于自然流产组,提示TSLP参与人正常妊娠的维持。单独孕酮、17β-E2或β-hCG并未显著促进滋养细胞TSLP mRNA的表达:而三者联合处理人Tros时,TSLP mRNA较未处理组升高9-12倍,培养上清中TSLP水平升高至28.23pg/ml。TNF-α与IL-4联合作用使TSLP mRNA水平升近2倍;而rhTSLP处理Tros,TSLP mRNA表达水平无显著升高。结论人母-胎界面表达TSLP,滋养细胞是其主要来源;正常早孕Tros表达水平显著高于不明原因自然流产患者。联合使用孕酮、17β-E2与β-hCG显著促进Tros转录TSLP mRNA,并促进Tros分泌TSLP。第二部分滋养细胞通过自分泌TSLP促进其增殖与侵袭目的分析rhTSLP对人滋养细胞生物学行为的影响。方法免疫化学法检测原代滋养细胞是否表达TSLP受体。不同浓度rhTSLP作用于原代滋养细胞48h后,采用[3H]thymidine摄取法及CCK8 kit分析滋养细胞增殖能力;采用transwell实验分析滋养细胞侵袭能力。结果免疫化学法检测到滋养细胞表达TSLP受体。外源TSLP能够促进原代滋养细胞增殖,在100-400ng/ml剂量范围内呈剂量依赖关系。rhTSLP亦促进滋养细胞侵袭。结论滋养细胞通过自分泌TSLP,促进自我增殖与侵袭,增强滋养细胞的生物活性;这将有利于妊娠的维持。第三部分人滋养细胞分泌TSLP诱导母-胎界面Th2型免疫优势目的了解Tros能否通过分泌TSLP训导dDCs促进母-胎界面Th2型免疫优势。方法流式细胞术检测蜕膜免疫活性细胞表面TSLP受体水平;以rhTSLP、LPS等处理MACS分选蜕膜DCs。Tros与DCs共培养,观察DCs分泌细胞因子的水平。将TSLP处理DCs,与同种或同个体蜕膜CD4+T细胞（dCD4+T）共培养,观察dCD4+T分泌的细胞因子表达谱;RT-PCR法检测dCD4+T细胞Th1/Th2型转录因子GATA-3与T-bet水平。结果正常早孕蜕膜内41.62%±6.84%dDCs表达TSLP功能性受体γ链（TSLPR-γ）,显著高于母-胎界面其他免疫细胞表达水平。rhTSLP刺激dDCs,或dDCs与Tros共培养24h后,dDCs被激活;活化dDCs分泌高水平IL-10与CCL17,及低水平TNF-α;TSLP中和抗体能够抑制Tros对dDCs的训导,使dDCs分泌IL-10与CCL17下降至对照组水平。rhTSLP或Tros培养上清处理dDCs 24h后,dDCs与dCD4+T细胞共培养5d,其培养上清Th2型细胞因子IL4、IL-10水平显著高于对照组;而Th1型因子IFN-γ与TNF-α水平显著低于对照组。dCD4+T细胞经TSLP-DCs作用7d后,其Th2型转录因子GATA-3水平显著升高。结论Tros通过分泌TSLP训导dDCs,并使dDCs分泌高水平IL-10与CCL17;TSLP-dDCs则诱导dCD4+T细胞呈现Th2型偏移,从而形成有利于正常妊娠的免疫微环境。第四部分人滋养细胞通过TSLP训导dDCs使dCD4+T细胞分化为调节性T细胞（Treg）目的研究Tros是否通过分泌TSLP训导dDCs,以诱导蜕膜Treg分化与扩增。方法rhTSLP、LPS等处理dDCs,或原代滋养细胞与dDCs共培养24h后,流式细胞术观察DCs表面标志的变化。将TSLP-DCs与同个体dCD4+CD25-T或dCD4+CD25+T细胞共培养7d,观察CD4+Foxp3+Treg数量与比例的变化,并以TGF-β中和抗体拮抗培养体系中TGF-β的功能,观察Treg比例的变化。同时观察诱导产生的Treg是否具有免疫无能性或免疫抑制性。结果Tros与dDCs共培养后,dDCs表面协同刺激分子CD80、CD86等显著升高。rhTSLP-dDCs与同个体dCD4+CD25-T或dCD4+CD25+T细胞共培养7d后,Treg明显扩增;且主要是CD4+Foxp3+Treg显著增多;这种诱导Treg分化与扩增的能力可以被TGF-β1中和抗体所抑制。母-胎界面诱导产生的Treg具有自身扩增无能与抑制CD4+CD25-T细胞增殖的能力。结论Tros通过分泌TSLP活化dDCs,并诱导dCD4+T细胞向CD4+Foxp3+Treg分化,这种诱导产生的Treg具有免疫无能性与免疫抑制性。小结本文通过RT-PCR、免疫化学及免疫印迹法检测到人母-胎界面表达胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）,并发现它在正常早孕的绒毛与蜕膜中表达水平显著高于不明原因流产组。rhTSLP处理或与Tros共培养后,dDCs表面协刺激分子与HLA-DR升高并且高水平分泌IL-10与CCL17。TSLP-dDCs能够诱导同种或同个体dCD4+T细胞向Th2型偏移;同时,TSLP-dDCs诱导同个体dCD4+T细胞分化发育为CD4+Foxp3+Treg,表明在母-胎界面局部存在Treg分化与扩增的机制。这些发现表明,来自胎儿成份的Tros,通过分泌TSLP,训导母体免疫细胞产生有利于妊娠的免疫微环境。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 正文
• 第一部分 TSLP在人母-胎界面表达及其调控
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 人滋养细胞通过自分泌TSLP促进其增殖与侵袭
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 人滋养细胞通过分泌TSLP诱导母-胎界面Th2型免疫优势
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 4+T细胞分化为调节性T细胞（Treg）'>第四部分 人滋养细胞通过TSLP训导蜕膜DCs使蜕膜CD⁴⁺T细胞分化为调节性T细胞（Treg）
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 综述
• 附录
• 附录1 中英文缩略语对照
• 附录2 博士生期间发表的论文和论著