一氧化碳对酒精性肝损伤的保护效应及其机制的研究

论文摘要

第一部分一氧化碳对肝细胞酒精性损伤的作用及相关机制的研究目的：以乙醇孵育的大鼠原代肝细胞为研究对象，探讨CO对肝细胞酒精性损伤的潜在保护作用，以及潜在的信号通路。方法：1．二步胶原酶灌注消化分离培养大鼠原代肝细胞，无水乙醇（200mmol/L）诱导肝细胞氧化损伤，单独或联合槲皮素（100μmol/L）、Hb（血红蛋白，CO清除剂，10μmol/L）处理24h，检测细胞培养基上清液中AST（aspartateaminotransferase）与LDH（lactate dehydrogenase）漏出水平和细胞内SOD（superoxide dismutase）活性、GSH（glutathione）水平、ROS（reactive oxygenspecies）及脂质过氧化产物MDA（malondialdehyde）水平；2．大鼠原代肝细胞乙醇染毒24h的同时，给予不同剂量的外源性CO释放分子CORM-2（carbon monoxide-releasing molecules-2，5～100μmol/L）或失活的CORM-2（iCORM-2）处理，观察上述氧化应激指标的变化，评价外源性CO对酒精所致氧化损伤的保护作用并确定CORM-2干预的最佳剂量；3．大鼠原代肝细胞乙醇孵育的同时，加入外源性炎症因子（tumor necrosisfactor a/TNF-a<5ng/ml>+interleukin-6/IL-6<2ng/ml>）诱导细胞炎性应激，以及CORM-2进行干预，观察上述氧化应激相关指标的变化；4．乙醇孵育的肝细胞在CORM-2干预的同时，加入ODQ （sGC抑制剂，40μmol/L）、SB203580（p38抑制剂，15μmol/L）、SP600125（JNK抑制剂，30μmol/L）或PD98059（ERK抑制剂，15μmol/L）酶抑制剂及特异性信号通路抑制剂处理24h，观察上述氧化应激指标的变化；5．大鼠原代肝细胞在乙醇和CORM-2干预24h后，提取细胞内总蛋白，Western blot检测p38、JNK、ERK的磷酸化水平。结果：1．槲皮素对乙醇染毒的肝细胞AST与LDH的漏出、细胞内GSH的消耗、SOD的失活、MDA与ROS的产生均有明显的抑制作用，而CO清除剂Hb则明显抑制了槲皮素的上述保护效应；2．中、高剂量的CORM-2（20～100μmol/L）对乙醇诱导的肝细胞AST与LDH漏出、GSH的消耗、SOD的失活及MDA与ROS的产生也有明显的抑制作用。因此，后续研究中选择20μmol/L的CORM-2作为干预剂量；3．外源性炎症因子与乙醇联合处理时，肝细胞AST与LDH的漏出、GSH的消耗、SOD的失活及MDA与ROS的生成明显加重，而CORM-2对细胞联合处理下氧化应激相关指标的变化具有明显的抑制作用；4．乙醇孵育的肝细胞在CORM-2干预的同时，加sGC的抑制剂ODQ及MAPK三条通路的特异性抑制剂，结果发现，ODQ及SB203580明显降低了CORM-2对肝细胞酒精性损伤的保护作用。5．乙醇孵育24h后，细胞内p38、JNK、ERK的磷酸化水平明显增加；给予CORM-2干预后，p38磷酸化水平进一步升高，而JNK、ERK的磷酸化水平则无明显变化。结论：CO对乙醇染毒的肝细胞氧化损伤及在此基础上叠加的炎性应激均具有保护作用；CO的保护作用可能与其激活sGC活性及p38MAPK磷酸化有关。第二部分一氧化碳对小鼠酒精性肝损伤的作用及相关机制的研究目的：进一步在动物整体水平探讨CO对酒精肝损伤的保护作用及潜在的信号通路。方法：Balb/c小鼠随机分为四组：对照组、酒精组、酒精+CORM-2组、CORM-2对照组，酒精组小鼠经口灌胃给予5.0g/kg.bw.乙醇（50%无水乙醇v/v，0.125ml/10g），连续三次（间隔12h），小鼠灌胃后立即尾静脉注射给予CORM-28mg/kg i.v.（0.25%DMSO溶解CORM-2），末次处理4h后处死，检测血清AST、ALT、TNF-α与IL-6水平，分析肝脏氧化损伤程度和p38、JNK、ERK的磷酸化水平，进一步确定CO保护酒精性肝损伤相关的信号通路。结果：1．与正常对照组相比，酒精组小鼠血清AST与ALT升高，肝脏组织GSH与SOD的消耗与失活增加、MDA与ROS的产生加剧；而CORM-2干预后小鼠肝脏的酒精性氧化损伤明显减轻；2．与酒精组相比，CORM-2降低了酒精染毒小鼠血清中促炎因子（TNF-α、IL-6）的水平，抑制了肝脏组织促炎症因子mRNA的表达，增加抗炎症因子IL-10mRNA的表达；3．酒精导致了小鼠肝脏组织中p38、JNK、ERK的磷酸化水平增加，而给予CORM-2干预后，p38的磷酸化水平进一步加剧，而JNK、ERK的磷酸化水平则无显著性变化。结论：CO对小鼠肝脏酒精性氧化损伤和炎症应激均具有明显的保护作用，CO的保护作用可能与其激活p38MAPK磷酸化有关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 一氧化碳对肝细胞酒精性损伤的作用及相关机制的研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二部分 一氧化碳对小鼠酒精性肝损伤的作用及相关机制的研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 小结
• 综述
• 5. 参考文献
• 附录 1.硕士期间参与发表、交流的论文
• 附录 2.课题资助情况
• 致谢