陈鹏李亭慧李雨
黑龙江中医药大学附属第一医院黑龙江哈尔滨150040
摘要：目的：在建立腹主动脉粥样硬化大鼠模型基础上，通过动物实验，探讨心脑通络液对动脉粥样硬化大鼠病变腹主动脉Caspase-3表达的影响，为治疗动脉粥样硬化的临床用药提供实验依据。方法：选取健康雄性大鼠40只，动物随机分为5组，即空白组、模型组、阿托伐他汀组、心脑通络液低剂量组、心脑通络液高剂量组。参照文献，采用高脂饲料饲养结合球囊损伤腹主动脉内膜制备动脉粥样硬化模型，连续喂养4周并结合球囊损伤腹主动脉内膜后，继续给药10周，末次给药后24小时，动物处死，取材。观察心脑通络液对动脉粥样硬化大鼠病变腹主动脉Caspase-3表达的影响.结果：1.腹主动脉粥样硬化大鼠模型复制成功；2.心脑通络液可抑制动脉粥样硬化大鼠腹主动脉细胞Caspase-3表达；结论：心脑通络液可抑制动脉粥样硬化大鼠腹主动脉细胞Caspase-3表达，起到抗凋亡作用。
关键词：心脑通络液；动脉粥样硬化AS
大量研究证明，动脉壁内皮损伤及脂质的沉积是目前公认的AS始动因素[1]，血液中的脂质在内皮下沉积。随后单核细胞黏附在内皮细胞损伤处进入内皮下，吞噬脂质成为泡沫细胞，形成脂肪斑。血小板也逐渐聚集并黏附于内皮的损伤处。吞噬细胞、内皮细胞及黏附于内皮细胞损伤处的血小板释放生长因子刺激平滑肌细胞进入内膜，增生并合成胶原纤维，脂肪斑演变成纤维斑块。随着这一过程的发展，脂质不断沉积，多种炎性细胞逐渐浸润，纤维帽渐渐变薄，慢慢演变为不稳定斑块。以不稳定斑块的裂缝、糜烂或破裂为基础形成血栓，最终导致严重心脑血管损害[2-4]。我们观察了心脑通络液对动脉粥样硬化大鼠病变腹主动脉Caspase-3表达的影响，现报道如下。
1.实验材料
1.1实验动物：健康SD大鼠40只，雄性，体重1.5～2.0kg，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。
1.2实验药物
1.2.1心脑通络液：由黄芪、地龙、桃仁、红花、当归尾、赤芍、川芎、太子参、水蛭、菟丝子等组成。有黑龙江中医药大学附属第一医院制剂室提供。
1.2.2阿乐（阿托伐他汀钙片）：规格，10mg/片，北京红惠生物制药有限公司。
1.3主要试剂：Caspase-3试剂盒武汉博士德生物工程有限公司
1.4主要仪器：酶标仪奥地利博塞ht2型、OLYMPUS光学显微镜日本BX60、病理图像数码分析系统麦克奥迪实业集团Med6.0
2.实验方法
2.1分组、给药
SD随机分成5组：空白组、模型组、阿托伐他汀组、心脑通络液低剂量组、心脑通络液高剂量组。除空白组喂普通基础饲料外，其余四组均喂高脂饲料，连续喂养4周并结合球囊损伤腹主动脉内膜后。正常对照组和模型对照组均给等体积蒸馏水；阿托伐他汀组予6mg/kg/d；心脑通络液高、低剂量组均给予心脑通络液10.71ml/kg/d（低剂量组给药前将心脑通络液用蒸馏水按1：1稀释），继续给药10周，末次给药后24小时，动物处死，取材。
2.2Caspase-3免疫组织化学检测
在造模成功1w、2w、4w、8w四个时间点，Caspase-3，大鼠肌肉注射速眠新（0.15mL/kg）麻醉后，取仰卧位，以腹主动脉病变部为中心进行组织取材约1cm，步骤如下：
（1）大鼠处死后，取腹主动脉血管组织标本，经4%多聚甲醛液固定，石蜡包埋，切片，脱蜡至水；
（2）3%H2O2室温静置10min，消除内源性过氧化物酶的活性；
（3）PBS液洗3次各5min；
（4）抗原热修复，将切片浸入0.01mmol/L枸椽酸钠缓冲溶液，微波炉里加热至沸腾；
（5）滴加50μl正常山羊血清封闭液，室温下孵育20min，甩去多余液体；
（6）滴加Ι抗50μl（l：100比例稀释），4℃冰箱过夜，阴性对照不加Ι抗；
（7）37℃复温45min，PBS液冲洗3次，滴加生物素标记Ⅱ抗，室温下孵育20min，PBS液冲洗；
（8）滴加50μl链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液，室温下孵育30min，PBS冲洗3次；
（9）DAB显色10min，在显微镜下掌握染色程度，PBS冲洗；
（10）苏木素复染2min，盐酸酒精分化，自来水冲洗；
（11）脱水、透明、封片、镜检。
使用病理图像分析系统对免疫组化染色切片进行分析。在200倍镜下每组随机取8张片，每张片4个视野，经显微镜摄像仪摄入，按512×512像素分布，并保存在病理图像分析系统内，用组化分析进行分析，先进行分割，选择点状分割将阳性物标记为棕黄色，除去非特异染色，记录阳性目标总面积和统计场总面积的比值（面密度），进行统计学处理。
2.3统计学处理
数据用均数±标准差（±s）表示，运用SPSS19.0统计软件处理，各组间比较采用单因素方差分析，然后用Student-Newman-KeulsTest进行每两组间比较，显著性差异水平以P<0.05为标准。
3.结果
各组大鼠Caspase-3的变化情况结果如表1所示：
表1各组大鼠Caspase-3变化情况（%，）
组别nCaspase-3
空白组82.45±0.41
模型组828.62±4.52
阿乐组814.42±2.76▲*
高剂量组816.33±3.78▲*#
低剂量组825.73±3.89▲*
注：与空白组比较▲P<0.05；与模型组比较，*P<0.05；与阿乐组比较，#P>0.05.
阿乐组与空白组相比，Caspase-3含量有明显升高（P<0.05）；与模型组相比，Caspase-3含量有降低（P<0.05）；
高剂量组与空白组相比，Caspase-3含量有明显升高（P<0.05）；与模型组相比，Caspase-3含量有降低（P<0.05）；与阿乐组相比，指标无显著差异（P>0.05）；
低剂量组与空白组相比，Caspase-3含量有明显升高（P<0.05）；与模型组相比，Caspases-3无明显差异（P<0.05）（P<0.05）。
4.讨论
关于心脑通络液对模型大鼠Caspase-3的影响
Caspase-3是推动细胞凋亡形成的主要因素之一，DNA损伤等胞内刺激引起线粒体通透性加大可产生氧自由基，将储存的钙离子泵入这些蛋白可激活Caspase-3这些蛋白中有细胞色素C它是激活Caspase-3的一种重要物质，Bc1-2可阻止细胞色素C由线粒体进入胞浆，同时阻止钙离子由线粒体进入胞浆，从而起到阻止细胞凋亡的作用[5-6]。
本实验结果显示，与空白组比较P<0.05；与模型组比较，P<0.05；与阿乐组比较，P>0.05.阿乐组与空白组相比，Caspase-3含量有明显升高（P<0.05）；与模型组相比，Caspase-3含量有降低（P<0.05）；高剂量组与空白组相比，Caspase-3含量有明显升高（P<0.05）；与模型组相比，Caspase-3含量有降低（P<0.05）；与阿乐组相比，指标无显著差异（P>0.05）；低剂量组与空白组相比，Caspase-3含量有明显升高（P<0.05）；与模型组相比，Caspases-3无明显差异（P<0.05）（P<0.05）。
参考文献：
[1]WereRMFAtherosclerosisandthetwofacesofendothelialnitricoxidesynthaseCirculation.1998.97：108一112
[2]FeherJ，etal.FreeradicalreactionsinmedicineSpringer-verlag，1987：74.
[3]OhtaMY，NagaiY，TakamuraT，etal.Inhibitoryeffectoftroglitazoneontumornecrosisfactoralpha-inducedexpressionofmonocytechemoattractantprotein-linhumanmesangialcells[J].Metabolism，2000，49（2）：163-6.
[4]GryglewskiRJ，ChlopickiS，UraczW，eta1.Significanceofendothelialprostaeyelinandnitricoxideinperipheralandpulmonarycirculation[J].MedSciMonit，2001，7（1）：1一16.
[5]ReedJCDoubleindentihforproteinsoftheBc1一2family[J]Ntzre1997.387773一776
[6]刘伟，李庆军．Caspase与细胞凋亡[J]．新乡医学院学报，2005；22（1）：67-70．
作者简介：陈鹏1976年2月，男，副主任医师，黑龙江中医药大学研究生导师，主要研究方向：中医药治疗心脑血管疾病。
基金项目：黑龙江省教育厅科学技术研究面上项目，项目编号：12531639