论文摘要
杏鲍菇（Pleurous eryngii）,又名杏仁鲍鱼菇,隶属侧耳属,是一种大型肉质伞菌,营养丰富,质地脆嫩,有“草原上的美味牛肝菌”之美誉。杏鲍菇氧化酶活性高,分解木质素能力强,可广泛应用于木质素降解和造纸业中酚废水的处理。杏鲍菇漆酶是一种酚氧化酶,其酶活性在食用菌中最高。平菇（Pleurotus ostreatus）是目前我国最为丰富的真菌种类资源之一,其最大特点是产量高。经过30多年发展,平菇已经成为我国栽培最为普遍、生产量最大的食用菌品种。2003年我国平菇总产量达273万t（鲜）,占我国当年食用菌总产量的26.3%。原生质体融合育种技术简便易行,可克服传统育种法中细胞壁和交配系统对育种的障碍,实现种间、属间以至远缘的杂交。双亲灭活原生质体融合减少了寻找稳定遗传标记的繁杂工作及由此可能带来的亲株优良性状的丢失,而且在不利用选择培养基的情况下可减少亲株生长,从而提高筛选效率。本课题确定了杏鲍菇原生质体制备最佳条件:菌龄为6 d,1.5%溶壁酶处理3.0 h,酶解温度30℃,0.6 mol/L甘露醇为渗透压稳定剂,原生质体产量达到2.95×107个/mL。平菇原生质体制备的最佳条件为培养5 d的菌丝体用1.5%溶壁酶酶解2.5 h,酶解温度30℃,0.6 mol/L甘露醇为渗透压稳定剂,原生质体产量达到2.78×107个/mL。适宜再生培养基组成为马铃薯200 g,葡萄糖20 g,酵母膏2 g,KH2PO4 3 g,MgSO4·7H2O 1.5 g,维生素B1 0.1 g,维生素B6 0.1 g,琼脂20 g,0.6 mol/L甘露醇,水1000 mL ,pH6.5。与涂布法比较,双层平板法更有利于原生质体再生,杏鲍菇和平菇再生率可分别达到0.68%和3.84%。杏鲍菇和平菇双亲菌株原生质体的灭活条件为:杏鲍菇原生质体采用紫外灭活,在30 W紫外灯、照射距离30 cm条件下处理20 min,灭活率达100%;平菇原生质体采用热灭活,65℃处理30 min,灭活率达100%。双亲原生质体电诱导融合的最佳条件为两亲本原生质体按1∶1混合,交变电场强度250 V/cm,交变电场频率为1 MHz,原生质体密度为105个/mL,成串时间为60 s,脉冲场强为5.5 kV/cm,脉冲时间常数为30μs,脉冲个数为5个。在此条件下杏鲍菇和平菇的原生质体存活率分别为72%、68%,融合率为3.2×10-3。从菌落特征、菌丝形态、拮抗试验等方面对融合子进行鉴定,从147株融合菌株中筛选得到1株理想菌株F49,其漆酶和TTC-脱氢酶酶活比亲本杏鲍菇和平菇分别提高了20.6%和25.3%,遗传稳定性分别达到92.0%和92.7%。融合株酯酶同工酶酶谱结果显示,融合株F49显示了杏鲍菇亲本的四条酶带,平菇亲本的三条酶带。由于染色体的交换和重组等相互作用,融合菌株F49缺失了杏鲍菇亲本的Rf=0.58和平菇亲本Rf=0.60的两条谱带。但融合菌株F49有其自身的3条酶带（Rf=0.65、Rf=0.84和Rf=0.92）,在双亲株中未显示,说明其有明显的自身特征,证实F49为融合株。
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中文摘要英文摘要1 引言1.1 杏鲍菇概述1.2 平菇概述1.3 食用菌原生质体融合1.3.1 食用菌原生质体融合技术在育种上的特点1.3.2 原生质体制备及影响因素1.3.3 原生质体融合方法1.3.4 亲本菌株的标记1.3.5 原生质体融合子的鉴定1.4 原生质体电诱导融合技术1.4.1 基本原理1.4.2 基本过程1.5 灭活原生质体融合技术1.5.1 灭活原生质体融合的机制1.5.2 灭活原生质体的方法1.6 本研究的目的和意义1.6.1 目的和意义1.6.2 创新之处2 材料与方法2.1 实验材料2.1.1 供试菌种2.1.2 培养基2.1.3 主要仪器设备2.1.4 主要试剂2.2 实验方法2.2.1 原生质体制备2.2.1.1 原生质体制备的基本方法2.2.1.1.1 酶液配制2.2.1.1.2 菌丝培养2.2.1.1.3 原生质体制备与计数2.2.1.2 原生质体制备的条件2.2.1.2.1 酶浓度对原生质体产量的影响2.2.1.2.2 酶解时间对原生质体产量的影响2.2.1.2.3 酶解温度对原生质体产量的影响2.2.1.2.4 稳渗剂种类对原生质体产量的影响2.2.1.2.5 培养时间对原生质体产量的影响2.2.2 原生质体再生2.2.2.1 原生质体纯化2.2.2.2 原生质体再生2.2.2.3 再生培养基的选择2.2.2.4 再生方式选择2.2.3 原生质体的融合2.2.3.1 原生质体的灭活2.2.3.2 电诱导原生质体融合2.2.3.3 原生质体融合率计算2.2.3.4 融合子的检验2.2.3.4.1 稳定性检验2.2.3.4.2 菌落特征比较2.2.3.4.3 融合子与亲本菌株的拮抗试验2.2.3.4.4 漆酶酶活测定2.2.3.4.5 TTC-脱氢酶酶活测定2.2.3.4.6 酯酶同工酶测定3 结果与分析3.1 原生质体的制备3.1.1 菌丝体的培养3.1.2 溶壁酶浓度对原生质体制备的影响3.1.3 酶解时间对原生质体制备的影响3.1.4 酶解温度对原生质体制备的影响3.1.5 渗透压稳定剂对原生质体制备的影响3.1.6 培养时间对原生质体制备的影响3.2 原生质体的再生3.2.1 再生培养基对原生质体再生的影响3.2.2 再生方式对原生质体再生的影响3.3 原生质体的融合3.3.1 原生质体灭活3.3.2 原生质体融合条件3.3.2.1 参数的初步选定3.3.2.2 交变电场强度的确定3.3.2.3 不同原生质体密度的成串效果3.3.2.4 成串时间对理想细胞成串率的影响3.3.2.5 成串过程中交变电场强度调整对理想细胞成串率的影响3.3.2.6 脉冲场强的确定3.3.2.7 脉冲时间常数的确定3.3.2.8 脉冲个数的确定3.3.2.9 原生质体电融合参数3.4 融合菌株的性状分析3.4.1 形态学分析及拮抗试验3.4.2 漆酶酶活和 TTC-脱氢酶酶活测定3.4.3 稳定性检验3.4.4 酯酶同工酶测定4 讨论4.1 原生质体制备4.2 原生质体再生4.3 原生质体融合4.4 双亲灭活原生质体4.5 漆酶和 TTC-脱氢酶酶活的测定4.6 尚待进一步开展的工作5 结论5.1 原生质体的制备5.2 原生质体的再生5.3 原生质体的融合条件5.4 融合子的检验6 参考文献7 致谢8 攻读学位期间发表论文情况
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标签：双亲灭活论文; 原生质体论文; 电诱导融合论文; 漆酶论文; 酯酶同工酶论文;
