论文摘要
土壤是微生物的良好生长环境,土壤中含有丰富的未知基因。传统的研究方法只能够反映极少部分的微生物生活特征和生态功能信息,并不能完全揭示土壤微生物群落的多样性和丰富性。为了更加深入的研究番茄灰霉病病株根际土壤中微生物含有的基因分布情况,本实验采用宏基因组学技术,从土壤中提取到DNA,纯化后进行双酶切,建立了宏基因组文库,文库中含有大量的未知抗灰霉病基因,从而为进一步研究和防治灰霉病提供了平台,也对宏基因组技术的在实际中的应用提供了一些参考。利用用土壤宏基因组提取试剂盒对番茄灰霉病病株根际土壤样品提取并纯化,通过PstⅠ与BamHⅠ双酶切、PstⅠ与EcoRⅠ双酶切、PstⅠ与EcoRⅣ双酶切和PstⅠ与HindⅢ双酶切四种组合双酶切预实验,确定PstⅠ与HindⅢ双酶切组合最佳。用此组合大量酶切土壤DNA和质粒pBluescriptⅡSK（+）,进行酶连重组,转入大肠杆菌培养,得到873个重组克隆子。从文库中随机挑选30克隆子进行文库的质量检查,检查结果显示片段的插入率为93.3%,最大插入的片段是2,700bp,最小的插入片段约为200bp,外源片段的平均插入大小是1,005bp。按照此比例,计算的出文库中阳性克隆子将包含大于1.6Mb的DNA插入片段。用灰葡萄孢霉菌对30个克隆子进行抑菌筛选试验,结果发现4#、9#、11#、14#、15#、17#阳性克隆子有抑菌作用,对其进行测序比对,4#、9#、17#的相似度很低,极有可能是新的基因,11#和15#相似度较高,但是其基因序列和蛋白质的功能还需要进一步验证。