出生至断奶仔猪胃肠道FcRn表达规律及其与IgG转运关系的研究

论文摘要

仔猪成活率一直是影响养猪业发展的重要因素之一,而母乳的免疫球蛋白水平及其向仔猪的转运对仔猪早期存活至关重要。刚出生的仔猪体内抗体基本为零,新生仔猪的免疫主要来自初乳中的母源抗体提供的被动免疫。IgG是家畜初乳中含量最丰富的免疫球蛋白成分,IgG由乳腺向乳汁中的分泌以及新生动物对乳中母源IgG的摄取均需要穿越上皮细胞屏障,即进行细胞转运作用,这一过程是由受体介导的,而特异性转运IgG的唯一受体是新生儿Fc受体（neonatal Fc receptor,FcRn）。研究表明,FcRn具有独特的重要功能,它不仅在IgG从母体到仔畜的转运中发挥着极其重要的作用,而且在成年动物体内终生表达,维持血液IgG和清蛋白水平的相对平衡和稳定,FcRn还与动物的生长发育和免疫应答密切相关。对该受体的研究可以揭示机体免疫球蛋白的转运机制,从而对临床应用和生产实践具有重要的理论指导价值。本研究以大白和长白二元杂交仔猪作为研究对象,分别采集从出生当天至断奶后共12个日龄仔猪血液和肝、肾、脾、心脏、胃以及肠道各段组织,进行了如下方面的试验。1.应用RT-PCR方法研究了FcRn在仔猪体内不同组织的表达分布及不同日龄仔猪胃肠道FcRn的表达变化。结果表明,FcRn在仔猪肝、肾、脾、心脏以及胃肠道各段组织中均有表达。经对FcRn/GAPDH电泳条带密度扫描分析,仔猪胃肠道中以十二指肠后段和空肠前段表达量最高,在十二指肠和空肠段,从一出生就有较高水平的FcRn转录,吮乳后至出生后1d达到峰值,4d后FcRn mRNA转录水平明显降低（P＜0.05）,至断奶时降到最低。回肠段FcRn表达水平较十二指肠和空肠段低,表达量变化不明显。胃与结肠部位FcRn的表达最低,且不同日龄间表达比较稳定。FcRn在仔猪十二指肠后段和空肠前段的高表达水平提示仔猪十二指肠、审肠是FcRn转运初乳中IgG的主要部位。2.应用实时荧光定量PCR方法,对仔猪肝脏和胃肠道组织中FcRn的表达进行了定量检测。根据GenBank公布的猪FcRn重链mRNA基因保守序列自行设计PCR引物和荧光探针,并以β-actin为管家基因,建立测定仔猪FcRn mRNA表达的实时荧光定量PCR方法。检测结果表明,FcRn在仔猪体内不同组织中表达水平有显著差异。其中,在肝脏中表达水平最高（△Ct=4.95）;其次是在十二指肠远端和空肠近端;十二指肠近端和空肠远端的表达量次之;在仔猪回肠和结肠部位均为低表达,且表达量极为接近;FcRn在仔猪胃内也有表达,但表达量最低（△Ct=6.91）。FcRn mRNA表达量随日龄的变化规律为:出生当天表达水平较低,未吃初乳（0w）和已吃初乳（0y）没有显著差异（P＞0.05）;1d时表达水平显著升高（P＜0.05）,随后维持在较稳定的水平直至21 d时有所下降;28 d时FcRn在胃肠道各部位表达均有显著升高（P＜0.05）;35 d时则普遍回落到与前期相近的水平。3.建立了检测仔猪小肠FcRn表达的地高辛标记探针原位杂交方法。根据GenBank公布的猪FcRn重链（α链）mRNA基因保守序列设计并合成带地高辛标记的原位杂交试验用cDNA探针。经仔猪小肠冰冻组织切片最佳厚度选择,以及H2O2溶液祛除小肠组织中内源性辣根过氧化物酶作用对杂交结果的影响,选择合适的固定剂、细胞膜蛋白消化剂、杂交液和确定杂交反应的温度、时间以及杂交后处理等一系列试验条件优化,建立了检测仔猪小肠FcRn mRNA的原位杂交方法。结果显示,原位杂交的最佳反应条件为:冰冻组织切片厚度为14μm;固定液采用4%多聚甲醛溶液,固定时间为1 h:杂交前用1%的Triton X-100处理切片15 min;采用含有50%去离子甲酰胺的Yeast RNA杂交液,每张切片滴加30μL～50μL:探针浓度为1.5μ/mL;杂交温度为46.8℃,时间为18 h;与辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体（anti-DIG-HRP）于4℃作用16 h后,用DAB显色10～15 min;切片最后用苏木素染色液复染。4.应用原位杂交方法研究了FcRn mPNA在仔猪小肠各段的表达分布特点,并利用相应软件进行了表达量分析。结果表明,在仔猪十二指肠、空肠和回肠组织的小肠上皮细胞和黏膜下层等部位均检测到清晰的杂交信号。其中,在小肠黏膜上皮检测到大量的FcRn mRNA阳性信号,尤其是空肠部位表达信号最强,其次是十二指肠远端,而在十二指肠近端和回肠段表达信号相对较弱;而小肠黏膜固有层的阳性信号主要集中在固有层内小血管周围,且以空肠部位为主;在十二指肠、空肠和回肠部位的黏膜下层均检测到FcRn mRNA阳性信号,其中在空肠黏膜下层表达最强。仔猪FcRn的表达动态为:出生3 d内FcRn在仔猪十二指肠、空肠和回肠部位均为高表达,3 d时出现显著下降,随后表达水平基本稳定,直至21 d后才出现回升。其中,十二指肠部位从仔猪一出生即高表达FcRn,而回肠部位FcRn的表达从3d开始直至断奶后一直维持在低水平。5.进行了仔猪血清IgG水平动态的检测,并分析了与小肠FcRn表达的相关性。利用放射免疫测定（RIA）检测了从初生到断奶阶段仔猪血液免疫球蛋白IgG的水平及其变化动态。结果表明,在出生后2 d内仔猪血液IgG抗体水平的变化与小肠FcRn表达量具有高度相关性,提示FcRn在新生仔猪肠道转运IgG过程中的主要作用。其中在仔猪刚出生时IgG含量为0,吸吮初乳后（0.5 d）水平迅速上升,至1d时达到峰值,而在3 d时IgG水平出现急剧下降,IgG水平在7d时达到第2次高峰,但从10d显著下降随后基本保持稳定,至35d时血液IgG水平又出现大幅度升高,达到4.74 mg/mL。对仔猪FcRn表达的定性、定位和定量检测均表明,FcRn mRNA在十二指肠远端和空肠近端呈现高水平表达,这与仔猪小肠的营养吸收特点相符,提示FcRn参与肠道IgG转运,在小肠吸收IgG过程中发挥转运受体作用。而FcRn mRNA在仔猪出生后3d内的高表达与新生仔猪吸收初乳的高峰时间及“肠关闭”时间相吻合,对仔猪血清IgG水平的检测也显示了新生仔猪IgG含量峰值的出现与FcRn在小肠的高表达存在一致性,说明了FcRn对新生动物获取足够被动免疫的重要性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号及缩略语
• 引言
• 第一部分 文献综述
• 第一章 转运免疫球蛋白的免疫球蛋白FC受体
• 1 免疫球蛋白Fc段受体
• 2 多体IgA受体（pIgR）
• 2.1 pIgR结构
• 2.2 pIgR转运
• 2.3 pIgR与Ig的相互作用
• 2.4 pIgR研究进展
• 2.4.1 pIgR的表达及其功能
• 2.4.2 pIgR研究前景
• 3 新生儿Fc受体（FcRn）
• 3.1 FcRn的组成与结构
• 3.3 FcRn结合IgG的pH依赖性
• 3.4 FcRn的生理学功能
• 3.4.1 FcRn参与IgG通过胎盘和卵黄囊的胞转作用（transcytosis）
• 3.4.2 FcRn通过肠上皮转运母体IgG分子
• 3.4.3 FcRn保护循环中的IgG免受降解
• 3.5 FcRn研究进展
• 第二章 仔猪的免疫特点
• 1 仔猪的被动免疫
• 1.1 乳中免疫球生白与被动免疫
• 1.2 乳中白细胞与被动免疫
• 1.3 乳中其它因素对被动免疫的影响
• 2 仔猪的主动免疫
• 2.1 血液免疫
• 2.1.1 先天免疫
• 2.1.2 仔猪外周血淋巴细胞特点
• 2.1.3 断奶应激的影响
• 2.2 黏膜免疫
• 2.2.1 肠道相关淋巴组织（Gut-associated lymphoid tissue,GALT）的组成
• 2.2.1.1 上皮细胞间淋巴细胞（intraepithelial lymphocyte,IEL）
• 2.2.1.2 肠集合淋巴结（Peyer's patches,PP）与M细胞（Membranous epithelial cell）
• 2.2.1.3 肠上皮细胞
• 2.2.1.4 分泌型IgA（SIgA）
• 2.2.1.5 固有层淋巴细胞（Lamina propria lymphocytes,LPL）
• 2.2.2 胃肠道黏膜免疫机制
• 3 仔猪肠道的特点及对免疫球蛋白的吸收
• 3.1 仔猪胃肠道的发育成熟
• 3.2 新生仔畜小肠的特点
• 3.2.1 小肠的结构特点
• 3.2.2 小肠的消化吸收和转运功能
• 3.3 仔猪小肠对IgG等大分子物质的吸收与转运
• 3.3.1 大分子蛋白的吸收和免疫性的传递
• 3.3.2 仔猪小肠吸收蛋白质的机制
• 第三章 哺乳动物FCRN及其研究前景
• 1 FcRn在哺乳动物体内的表达
• 2 FcRn与母乳IgG的转运
• 3 FcRn与免疫应答
• 4 FcRn的研究意义
• 4.1 FcRn与自身免疫病的治疗
• 4.2 FcRn与IgG分子改造
• 4.3 以FcRn为载体的新型药物与疫苗的开发
• 4.4 FcRn与遗传育种
• 第二部分 试验研究
• 第四章 FCRN在仔猪体内表达的定性检测
• 1 材料与方法
• 1.1 试验时间、地点
• 1.2 试验材料
• 1.2.1 待检组织样品
• 1.2.2 主要试剂及工具酶
• 1.2.2.1 大肠杆菌感受态细胞制备、转化及诱导溶液
• 1.2.2.2 质粒DNA提取溶液
• 1.2.2.3 其它溶液
• 1.2.3 主要仪器
• 1.3 方法
• 1.3.1 PCR引物的设计及合成
• 1.3.2 仔猪组织总RNA的提取及cDNA合成
• 1.3.3 PCR检测与目的DNA片段测序
• 1.3.4 扩增片段的回收、转化和序列鉴定
• 1.3.5 FcRn表达量的相对分析
• 2 结果
• 2.1 仔猪体内组织中FcRn的表达
• 2.2 FcRn在仔猪胃肠道中的表达分布
• 2.3 不同日龄仔猪胃肠道中FcRn mRNA转录水平的相对定量与分析
• 3 讨论
• 第五章 FCRN MRNA在仔猪胃肠道表达的定量检测及其表达规律
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 试验动物与样品采集
• 1.1.2 主要试剂及工具酶
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 定量PCR引物与探针的设计及合成
• 1.2.2 仔猪胃肠道组织总RNA的提取
• 1.2.3 RT-PCR
• 1.2.3.1 逆转录反应
• 1.2.3.2 PCR反应
• 1.2.3.3 相对定量方法
• 1.2.4 数据处理和统计学分析
• 2.结果
• 2.1 RNA纯度测定
• 2.2 基因的扩增
• 2.3 不同日龄仔猪肝脏和胃肠道组织中FcRn表达量的变化
• 2.3.1 肝脏
• 2.3.2 胃
• 2.3.3 十二指肠
• 2.3.4 空肠
• 2.3.5 回肠
• 2.3.6 结肠
• 2.4 FcRn在仔猪肝脏和胃肠道不同部位的表达水平差异
• 3 讨论
• 3.1 关于定量PCR技术
• 3.2 仔猪胃肠道FcRn表达与其它动物的比较
• 3.3 关于仔猪肝脏FcRn高表达的探讨
• 第六章 FCRN在仔猪胃肠道组织表达的定位检测及其变化动态
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 试验动物与样品采集
• 1.1.2 主要仪器设备
• 1.1.3 主要试剂和试剂盒
• 1.1.3.1 Leica冰冻切片包埋剂
• 1.1.3.2 DAB（3,3—二氨基联苯胺）显色试剂盒
• 1.1.3.3 ISH杂交液
• 1.1.3.4 标记有辣根过氧化物酶的抗地高辛抗体（anti-DIG-HRP）
• 1.1.3.5 其它试剂
• 1.2 探针的制备
• 1.3 原位杂交方法的建立
• 1.3.1 组织切片厚度的确定
• 1.3.2 固定
• 1.3.3 杂交前处理
• 1.3.3.1 祛除内源性辣根过氧化物酶（HRP）对杂交信号的影响
• 1.3.3.2 消化细胞膜蛋白
• 1.3.4 预杂交
• 1.3.5 杂交
• 1.3.6 杂交后处理
• 1.3.7 显色
• 1.3.8 复染
• 1.3.9 观察
• 1.4 原位杂交结果的观察与分析
• 1.5 数据统计
• 2 结果与分析
• 2.1 原位杂交条件的优化
• 2.1.1 切片最佳厚度的确定
• 2.1.2 内源性辣根过氧化物酶（HRP）的祛除效果
• 2.1.3 原位杂交效果
• 2.2 FcRn在仔猪小肠表达的定位检测结果
• 2.2.1 FcRn mRNA在仔猪小肠黏膜上皮的表达
• 2.2.2 FcRn mRNA在仔猪小肠黏膜固有层的表达
• 2.2.3 FcRn mRNA在仔猪小肠黏膜下层的表达
• 2.3 FcRn mRNA在仔猪小肠表达的相对定量
• 3 讨论
• 3.1 原位杂交方法的应用及其在本研究中的意义
• 3.2 本研究中对原位杂交方法的改进
• 3.3 小肠FcRn mRNA原位杂交的定位分析
• 第七章 仔猪血液IGG水平动态变化及其与FCRN表达的相关性分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验动物及分组
• 1.2 样品采集
• 1.3 主要试剂和试剂盒
• 1.3.1 FCM用鼠抗猪单克隆抗体
• 1.3.2 IgG RIA试剂盒
• 1.3.3 其它试剂
• 1.4 主要仪器设备
• 1.5 血清IgG的RIA测定
• 1.6 数据处理与分析
• 2 结果与分析
• 2.1 仔猪从出生至断奶后血液IgG水平的变化动态
• 2.2 仔猪血液IgG水平与同时期小肠FcRn表达水平的相关性分析
• 3 讨论
• 3.1 关于仔猪的体液免疫
• 3.2 FcRn与仔猪免疫的相关性
• 第三部分 全文结论
• 第四部分 参考文献
• 附录:攻读博士学位期间发表的相关科研论文