论文摘要
目的颈椎后纵韧带骨化症（ossification of posterior Iongitudinal ligament,OPLL）是临床上常见的脊柱疾患,发病率可高达20%～34%。OPLL的致瘫几率显著高于其他颈椎退变性疾病,其原因包括缺乏有效的早期筛选和诊断方法、自然史不明无法确定手术时机、术后骨化物持续生长等。近年来对其发病机制的研究取得了一些成果,如COL6A1限制性片段多态性与OPLL相关、应力因素是骨化灶进展的重要局部因素等,但其发病机制仍不明确。本研究采用差异蛋白质组学方法,以荧光差异凝胶电泳（differential gel electrophoresis,DIGE）及质谱技术筛选并鉴定OPLL患者颈椎后纵韧带组织中差异表达蛋白质,以期寻找OPLL发生、发展过程中特异的蛋白标记物,为临床OPLL筛查和诊断、预后判断、寻找治疗药物靶点、了解OPLL发生发展的分子机制提供研究基础。方法以颈椎前路椎体次全切除术中获得的OPLL后纵韧带组织和外伤患者正常后纵韧带组织做为研究对象。液氮研磨、超声破碎抽提组织全息蛋白质样本,普通双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis,2-DE）分离,银染显色鉴定蛋白质样本质量。以Cy3、Cy5及Cy2荧光素标记的OPLL颈椎后纵韧带组织及健康外伤患者韧带组织的蛋白质标本各50ug进行2-DE,以所有样本等量混合物50ug做为内参,获得其荧光差异表达图谱,DeCyder 6.5图谱分析软件（GE healthcare公司）进行胶内、生物学差异分析,确定表达存在差异的蛋白质点。加大上样量同法获得普通2-DE制备胶,手工切胶后酶解获得肽段样本。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrum,MALDI-TOF MS）或液相色谱串联质谱技术（Liquid chromatography-Mass spectrum,LC/MS）进行鉴定并分析差异表达的蛋白质点。文献回顾总结各差异蛋白的基本信息、分子功能、细胞分布及其参与的生命过程,推测其在OPLL发病机制中的可能作用。对有深入研究价值的差异表达蛋白质采用实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-TimeQuantitive Polymerase Chain Reaction RT-PCR）技术从mRNA水平进一步验证DIGE及质谱结果准确性。结果超声破碎后行普通2-DE获得10张2-DE图谱,图谱重复性好,蛋白质抽提、分离情况及电泳条件满意。行荧光差异双向凝胶电泳获得4张荧光胶图及12张模拟胶图,每张胶图上共约1100个蛋白质点。胶间比较（Biological VariationAnalysis,BVA）共筛选出50个差异表达蛋白质点,其中8个蛋白质点在OPLL韧带组织中上调,42个蛋白质点下调;最大上调比例为2.74倍;最大下调比例为7.42倍。手工切胶获得45个蛋白质点的肽段样本,分别采用MALDI-TOF MS、MALDI-TOF-TOF MS和高效液相色谱联用质谱,鉴定为28个蛋白质或肽段。文献回顾后根据蛋白质功能的不同,将其分为7类:转运和结合蛋白、代谢酶类、血纤维蛋白、免疫球蛋白、细胞结构蛋白、信号蛋白和未知功能蛋白。其中Ⅵα1的编码基因COL6A1在近年对孪生子和OPLL家系的研究中已确定为OPLL发病的重要危险因素,本研究首次确认其在蛋白水平存在差异表达;与胶原蛋白代谢相关的酶PRELP在OPLL韧带组织中表达亦有减少,该酶的功能目前尚不完全明确;OGN与骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）存在协同关系,后者目前已经发现的最重要的诱导成骨因子;N-RAP具有应力传导的作用,而应力已被证实是OPLL病情进展的重要局部因素,N-RAP有可能在力学信号转化为生物信号的过程中发挥一定作用。RT-PCR验证实验发现碳酸酐酶（carbonic anhydraseⅠ,CA1）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖的激素脱氢酶（NAD（P）dependent steroid dehydrogenase-like,NDSHL）,骨生成诱导因子（osteoglycin OG,OGN）,Ⅵ型胶原α链（alpha-1 collagenⅥ,Ⅵα1）在OPLL韧带组织中mRNA拷贝数低于正常韧带组织,但CA1、OGN的结果差异无统计学意义。胆绿素还原酶B（biliverdin reductase B,BVRB）,伴肌动蛋白相关锚定蛋白（nebulin-related anchoring protein,N-RAP）在OPLL韧带组织中mRNA拷贝数高于正常韧带组织,但BVRB的结果差异无统计学意义。另外,本研究发现一个假设蛋白和一个未命名蛋白在胃癌组织中表达上调,它们可能与OPLL的发生、发展有关。结论本研究探索了后纵韧带组织全蛋白质的抽提方法,成功制备了OPLL韧带组织和正常后纵韧带组织的双向凝胶,初步建立了颈椎后纵韧带组织的2-DE参考凝胶图谱。应用DIGE技术探索了OPLL的发病机制,建立了定量比较蛋白质组学的技术路线。以往OPLL发病机制研究停留在分子遗传学领域或针对个别蛋白质的局限性,本研究首次把定量比较蛋白质组学应用于OPLL发病机制的研究,为临床相关疾病的同类研究进行了技术探索。DIGE实验筛选出Ⅵα1表达存在差异,与既往研究吻合,在一定程度上验证了DIGE实验的准确性。在DIGE筛选出的差异表达蛋白质中可能存在与OPLL发生、发展相关的重要蛋白,为进一步深入研究OPLL发病机制提供了研究基础。初步的鉴定研究提示,胶原蛋白的表达和代谢异常在OPLL的发生发展过程中有重要作用。RT-PCR实验中,OGN、BVRB实验结果与DIGE和质谱实验结果不符合,考虑有可能是样本量、实验误差或RNA-蛋白之间的不一致性导致。下一步,我们将对质谱鉴定的差异蛋白进行免疫组化、ELISA等实验以及RNA干扰,进一步验证其表达变化,深入研究这些蛋白在OPLL的发生、发展过程中可能的作用,为发现诊断及预后判断的蛋白标志物,寻找治疗药物靶点,了解OPLL发生、发展过程提供了理论依据。