产石杉碱甲蛇足石杉内生真菌的分离与鉴定

论文摘要

石杉碱甲（Huperzine A）是从药用蕨类植物蛇足石杉[Huperzia serrata （Thunb. ex Murray） Trev.]中率先分离得到的一种天然新型石松生物碱（Lycopodium alkaloids）,具有高效、高选择性的乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase,AChE）抑制活性,是目前治疗阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease,简称AD）最具前景的生物碱类药物。迄今,由于化学合成、人工栽培及细胞培养等生产技术一直无法突破,石杉碱甲仅能从野生蛇足石杉等石松属植物中提取。但蛇足石杉等石松植物石杉碱甲含量低、生长缓慢、野生资源十分有限,存在原料短缺和环境破坏等严重问题。因此,要从根本上解决石杉碱甲的药源问题,寻求新的有效途径势在必行。近年来的研究表明植物内生真菌可产生与宿主植物相同或相似的生物活性物质。迄今,国内外已有分离获得产石杉碱甲内生真菌的报道,使得利用内生真菌生产药物活性化合物成为一种可供选择的有效途径。鉴于药用植物内生真菌的重要生物活性,本研究以江西省中科院庐山植物园野生蛇足石杉为材料,对其开展内生真菌的分离筛选,以期从中勘探获得高效抑制AChE活性和产石杉碱甲的内生真菌,为利用内生真菌发酵实现工业化生产石杉碱甲奠定基础。本研究从蛇足石杉组织中共计分离获得127株内生真菌,分属于Penicillium sp.、Aspergillus sp.、Cladosporium sp.、Colletotrichum sp.、Chaunopycnis sp.、Acremonium sp.、Capronia sp.、Mortierella sp.、Botrytis sp.、Coniothyrium sp.、Paraphaeosphaeria sp.、Leptosphaeria sp.、Shiraia sp.、Alternaria sp.和Podospora sp.等19个属,包括10个可能的潜在新种和4个潜在新属。Penicillium sp.、Podospora sp.和Aspergillus sp.为优势类群,相对频率分别为15.7%、11.8%和11.0%。根、茎、叶中内生真菌的分布存在一定的组织差异性,茎中内生真菌的分离率、定殖率和多样性指数最高,叶中次之,根中最少。体外AChE抑制活性检测结果显示,共有15个属的39株内生真菌显示出AChE抑制活性,其中11株有显著的抑制活性,其抑制率范围在60.2%96.5%,且主要是从蛇足石杉叶部分离得到（7株）。TLC、UV-HPLC、ESI-MS分析结果表明,共有来自Penicillium sp.、Acremonium sp.、Aspergillus sp.、Shiraia sp.等7个属的9株内生真菌产石杉碱甲,其中以菌株Aspergillus flavus LF40和Cladosporium cladosporioides LF70的产量较高,含量分别为80.1μg/gdcw和56.84μg/gdcw。从蛇足石杉叶片组织分离获得产石杉碱甲内生真菌的数量最多,有7株,茎和根中各仅有1株,显示出产石杉碱甲蛇足石杉内生真菌分布的组织差异。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 植物内生真菌综述
• 1.1 植物内生真菌研究概述
• 1.2 植物内生真菌多样性研究
• 1.3 植物内生真菌多样性研究方法
• 1.4 药用植物内生真菌与宿主活性成分的相关性研究
• 2 药用植物蛇足石杉概况
• 2.1 蛇足石杉简介
• 2.2 生物学特性
• 2.3 资源分布及生境
• 2.4 石杉碱甲（Huperzine A）研究进展
• 3 研究意义和研究内容
• 3.1 研究目的和意义
• 3.2 研究内容
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 供试植物材料
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要实验试剂
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 蛇足石杉植株表面消毒
• 2.2.2 内生真菌的分离纯化
• 2.2.3 蛇足石杉植株表面消毒效果检测
• 2.2.4 内生真菌的保藏
• 2.2.5 内生真菌的形态学鉴定
• 2.2.6 内生真菌分子生物学鉴定
• 2.2.7 内生真菌摇瓶发酵培养及发酵提取物的制备
• 2.2.8 内生真菌的乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制活性检测
• 2.2.9 产石杉碱甲内生真菌菌株的筛选
• 2.2.10 数据处理
• 第三章 蛇足石杉内生真菌的分离和鉴定
• 3.1 前言
• 3.2 蛇足石杉内生真菌的分离结果
• 3.3 内生真菌的形态学分类
• 3.4 内生真菌的ITS-rDNA 序列分析
• 3.5 内生真菌的种群结构及多样性
• 3.6 本章小结
• 第四章 产石杉碱甲蛇足石杉内生真菌的筛选
• 4.1 前言
• 4.2 内生真菌的乙酰胆碱酯酶抑制活性
• 4.3 内生真菌代谢产物薄层层析（TLC）检测
• 4.4 内生真菌代谢产物高效液相色谱（HPLC）检测
• 4.4.1 紫外全波段扫描（UV）分析
• 4.4.2 高效液相色谱（HPLC）检测
• 4.5 内生真菌代谢产物质谱（ESI-MS）检测
• 4.6 产石杉碱甲蛇足石杉内生真菌的组织分布特点
• 4.7 本章小结
• 第五章 产石杉碱甲内生真菌LF40 和LF70 的鉴定
• 5.1 前言
• 5.2 菌株LF40 的鉴定
• 5.2.1 菌株形态学鉴定
• 5.2.2 菌株LF40 的ITS 序列登录号及系统发育分析
• 5.3 菌株LF70 的鉴定
• 5.3.1 菌株形态学鉴定
• 5.3.2 菌株LF70 的ITS 序列登录号及系统发育分析
• 5.4 产石杉碱甲蛇足石杉内生真菌发现的意义
• 5.5 本章小结
• 第六章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附： 本人读研期间发表论文情况