水稻抗纹枯病QTL qSB-9Tq的遗传分析和精细定位研究

论文摘要

纹枯病是世界性的水稻3大病害之一。水稻对纹枯病的抗性属于典型的数量性状。迄今,在水稻的多个研究群体上一共检测到30个左右的抗纹枯病QTL,涉及全部的水稻12条染色体。水稻第9染色体是发现抗纹枯病QTL次数最多的染色体。其中来自相对抗病品种特青（Teqing）第9染色体的抗纹枯病QTL qSB-9Tq被不同研究者多次定位到,具有较高的重演性,并受到较多的关注。因此,本研究围绕qSB-9Tq开展了一系列的遗传研究,并对其进行了精细定位。主要研究结果如下。采用标记辅助选择结合性状鉴定的回交验证策略,构建了Teqing与相对感病亲本Lemont（轮回亲本）的回交群体,每个回交世代均以RM201和RM6971作为qSB-9Tq的双侧标记对其进行选择。于回交BC5F1世代证实qSB-9Tq是一个真实的抗性QTL（QRL,quantitative resistance locous）,而且利用分子标记RM201和RM6971对其选择是有效的。在此基础上,为了更精确地评价qSB-9Tq的抗病效应,我们适当扩大目标区间的选择范围,利用覆盖该QRL置信区间的7个多态性分子标记进行前景选择,于BC61世代用114个均匀覆盖水稻12条染色体的分子标记对前景选择的中选单株进行背景选择,从中筛选出前景标记基因型均为杂合型,且在所有背景标记位点上均与轮回亲本Lemont完全一致的1个单株。连续两年对该单株的扩繁后代（BC6F2）及随后获得的近等基因系（BC6F3）采取完全随机试验和随机区组试验2种不同的试验设计,对qSB-9TqTq纯合型、qSB-9LeLe纯合型和qSB-9TqLe杂合型等3种基因型个体（BC6F2）和近等基因系（BC6F3）间的病级差异分别进行统计分析。结果表明:两种实验设计结果表现出一致的趋势,即qSB-9Tq存在于分子标记RM242-Y92.5之间,可减轻病级0.7-1级（0-9级病情分级系统）左右,且其抗性表现为几乎完全的显性特征。之前在水稻品种Jasmine85和明恢63（Minghui63）的第9染色体上也分别定位到抗纹枯病QTL,根据其有利等位基因的来源分别被命名为qSB-9J85和qSB-9MH63。通过分子标记与水稻物理图谱间的整合分析,发现qSB-9J85、qSB-9MH63和qSB-9Tq等3个QTL的置信区间相近或局部重叠。采用标记辅助选择结合性状鉴定的回交验证策略,以感病亲本Lemont为轮回亲本构建Jasmine85/Lemont和Minghui63/Lemont两个回交组合的拟染色体片段代换系群体。在两个不同的回交世代对这2个QTL进行了验证,证实qSB-9J85和qSB-9MH63真实位于第9染色体上的分子标记RM6971-RM201区间内,而根据上述分析,qSB-9Tq也很可能位于该区间内。这3个QRL在杂合状态下平均可减轻病级1.0级左右,初步推测它们可能是同一个QRL。本课题组之前已经利用Teqing/Lemont（轮回亲本）组合的回交群体证实了水稻品种Lemont第11染色体上的抗纹枯病QTL qSB-11Le。本研究利用相同组合,也证实了来自Teqing第7染色体的抗水稻纹枯病QTLqSB-7Tq。在此基础上,为了研究qSB-9Tq与这两个QRL之间的聚合效应及相互之间的互作关系,我们利用3个QRL的双侧分子标记辅助连续回交结合性状鉴定,通过将Teqing与Lemont（轮回亲本）杂交并连续回交,构建了这3个QRL的一套近等基因系。在一致的遗传背景下,对各QRL的主效应、聚合效应及其互作关系进行了研究。结果显示,3个QRL单独存在或在聚合状态下均能显著提高水稻品种对纹枯病的抗性水平,而且,不同QRL之间普遍存在互作关系。为了更有效地开展qSB-9Tq的标记辅助育种以及对其进行克隆和抗性机理的研究,我们采用构建目标区间染色体单片段叠代系的策略,对qSB-9Tq进行了精细定位研究。首先在其选择区间RM242-Y92.5（第三章）以及外侧一定距离内,发展和筛选到在两个亲本间具有多态的PCR分子标记共22个,其平均物理间距为319.753kb,可较高密度地覆盖整个大区间。利用这些分子标记,对本论文第三章近等基因系构建过程中获得的1个BC6F1中选单株（背景为轮回亲本Lemont基因型,仅在目标大区间为杂合基因型）进行标记检测,结果显示该单株的22个标记位点均为杂合型。随后我们对其自交后代进行标记检测,并根据不同的标记基因型,构建了在不同标记间发生交换重组的44类共894个染色体单片段代换系（染色体单片段叠代系）。于2007年正季选择其中的240个叠代系,进行2个区组重复的田间接种试验,于抽穗期后30天调查各叠代系的病级和病指。随后对各叠代系的几个主要农艺性状进行调查,并发现在大区间内存在一个控制分蘖角的主效QTL（大分蘖角基因来自供体亲本Teqing）。为了排除该分蘖角QTL对病情的干扰,我们选择不携带该大分蘖角基因的叠代系对qSB-9Tq进行精细定位。对叠代系两个重复的病级和病指进行联合聚类分析。采用的聚类方法分别为系统聚类的离差平方和法,以及动态聚类的最小组内平方和法。以动态聚类结果为基础,系统聚类方法结果为参考,对各叠代系进行抗感分型并确定目标QTL的左右边界,从而实现qSB-9Tq的精细定位。结果表明,在整个目标大区间内存在2个抗纹枯病QTL,分别位于分蘖角QTL的左侧和右侧,分别命名这2个QTL为L-qSB-9Tq和R-qSB-9Tq。这两个QRL的物理区间分别为Z77.2-Y77.7和Y86-Y90.2,区间大小分别为180.875Kb和207.724 kb。综上所述,本研究首次在近等基因系的水平下,研究了一个水稻抗纹枯病QTL qSB-9Tq的效应和作用方式。该QRL的抗性表现为几乎完全的显性,预示着其在水稻杂种优势利用方面具有较大的应用潜力。同时,该QRL与qSB-11Le和qSB-7Tq之间存在的互作关系,也暗示着其在分子标记辅助聚合育种中具有潜在的利用价值。进一步对其进行精细定位研究,不仅可以更高效地进行qSB-9Tq的分子标记辅助育种,而且还将为该QRL的克隆和数量抗性机理研究打下坚实的基础。

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 文献综述
• 第一章 植物抗病基因的克隆
• 1.1 质量抗病基因克隆
• 1.1.1 已克隆的质量抗病基因及其结构特征
• 1.1.2 质量抗病基因的克隆策略
• 1.1.2.1 图位克隆法
• 1.1.2.2 插入突变克隆策略
• 1.2 数量抗病基因克隆的研究现状
• 1.2.1 数量抗病基因的克隆策略
• 1.2.1.1 数量抗病基因图位克隆的研究策略
• 1.2.1.2 芯片表达谱技术在数量基因克隆研究中的应用
• 1.2.2 数量抗病基因可能的作用机理和抗性特征
• 1.3 参考文献
• 第二章 水稻抗纹枯病研究进展
• 2.1 水稻抗纹枯病种质资源的筛选和创新
• 2.2 水稻对纹枯病抗性的遗传及抗性机制研究
• 2.2.1 纹枯病抗性的遗传研究
• 2.2.2 抗纹枯病QTL的定位研究
• 2.2.3 抗纹枯病相关基因研究
• 2.2.4 影响纹枯病抗性的其它可能机制
• 2.2.5 影响纹枯病抗性的其他因素
• 2.3 水稻对纹枯病抗性的鉴定体系研究
• 2.3.1 成株期大田抗性鉴定体系
• 2.3.1.1 接种方法
• 2.3.1.2 接种时期
• 2.3.1.3 调查时期
• 2.3.1.4 病情评价指标
• 2.3.2 苗期温室抗性鉴定体系
• 2.4 抗纹枯病QTL的分子标记辅助育种研究
• 2.5 参考文献
• 第二部分 研究报告
• Tq的效应及其作用方式分析'>第三章 qSB-9^Tq的效应及其作用方式分析
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 水稻材料
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.2.1 分子标记发展和筛选
• 3.2.2.2 标记检测
• 5F₁亚群、BC₆F₂分离群体和 BC₆F₃近等基因系的获得'>3.2.2.3 BC₅F₁亚群、BC₆F₂分离群体和 BC₆F₃近等基因系的获得
• Tq真实性验证和效应分析实验的田间设计'>3.2.2.4 qSB-9^Tq真实性验证和效应分析实验的田间设计
• 3.2.2.5 纹枯病菌接种及抗性鉴定
• 6F₃近等基因系群体性状特征比较'>3.2.2.6 BC₆F₃近等基因系群体性状特征比较
• 3.2.2.7 数据分析
• 3.3 结果与分析
• Tq的区间验证'>3.3.1 qSB-9^Tq的区间验证
• 3.3.2 前景选择和背景选择分子标记的获得
• 3.3.3 近等基因系群体特征分析
• Tq的抗性效应和作用方式分析'>3.3.4 qSB-9^Tq的抗性效应和作用方式分析
• 3.4 讨论
• 3.4.1 标记基因型检测和性状调查相结合的回交鉴定方法，是快速验证QTL所在遗传区间的有效方法
• Tq的效应和作用方式'>3.4.2 关于qSB-9^Tq的效应和作用方式
• 3.4.3 创造一个没有任何抗性基因的更感病系，可以更准确地鉴定抗性数量基因的效应和互作效应
• 3.5 参考文献
• 第四章 来自不同水稻亲本的抗纹枯病 QTL qSB-9的区间验证
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 水稻材料
• 4.2.2 实验方法
• 4.2.2.1 标记整合与标记发展
• 4.2.2.2 标记检测
• 4.2.2.3 群体创建
• 4.2.2.4 田间试验及设计
• 4.2.2.5 纹枯病菌接种及抗性鉴定
• 4.2.2.6 数据分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 第9染色体上各个抗纹枯病QTL区间的标记整合结果
• J85和qSB-9^MH63的区间验证'>4.3.2 qSB-9^J85和qSB-9^MH63的区间验证
• J85和qSB-9^MH63的效应分析'>4.3.3 qSB-9^J85和qSB-9^MH63的效应分析
• 4.4 讨论
• 4.4.1 构建拟染色体片段叠代系是界定 QTL物理区间的有效方法
• 4.5 参考文献
• Tq与另外两个抗水稻纹枯病 QTL的聚合效应分析'>第五章 qSB-9^Tq与另外两个抗水稻纹枯病 QTL的聚合效应分析
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 水稻材料
• 5.2.2 实验方法
• 5.2.2.1 标记检测
• 5.2.2.2 近等基因系构建
• 5.2.2.3 纹枯病接种方法及抗性鉴定
• 5.2.2.4 田间试验设计
• 5.2.2.5 数据分析
• 5.3 结果与分析
• Tq的真实性验证'>5.3.1 qSB-7^Tq的真实性验证
• 5.3.2 3个 QRL的抗性效应及其聚合效应分析
• 5.3.3 3个 QRL互作效应的初步分析
• 5.4 讨论
• 5.4.1 创建一个更感病系，可更精确地研究QRL的效应
• 5.4.2 QTL间的互作对聚合抗病育种的意义
• 5.5 参考文献
• Tq的精细定位研究'>第六章 抗水稻纹枯病 QTL qSB-9^Tq的精细定位研究
• 6.1 前言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 水稻材料
• 6.2.2 实验方法
• 6.2.2.1 标记发展方法
• 6.2.2.2 标记检测
• 6.2.2.3 染色体单片段代换系构建及群体特征调查
• 6.2.2.4 纹枯病菌接种及抗性鉴定
• 6.2.2.5 田间试验设计
• Tq的精细定位'>6.2.2.6 qSB-9^Tq的精细定位
• 6.2.2.7 精细定位所用统计分析软件
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 分子标记获得
• 6.3.2 叠代系的获得
• 6.3.3 叠代系之间的农艺性状特征比较
• Tq的精细定位'>6.3.4 qSB-9^Tq的精细定位
• 6.4 讨论
• 6.4.1 染色体单片段代换系是精细定位数量抗病基因的理想材料
• 6.4.2 关于抗水稻纹枯病 QTL精细定位过程中的数据处理
• Tq的认识'>6.4.3 对qSB-9^Tq的认识
• 6.5 参考文献
• 下一步试验计划
• 附录 TPS法提取水稻核基因组DNA
• 致谢
• 博士研究生期间发表的论文