乙型脑炎重组杆状病毒疫苗的研究

论文摘要

日本乙型脑炎（Japanese encephalitis,JE）简称乙脑,是一种由乙脑病毒（Japaneseencephalitis virus,JEV）引起的人畜共患传染病。该病可引起种猪繁殖障碍,给养猪业造成了巨大的经济损失。同时,乙型脑炎还是人类中枢神经系统最常见的虫媒病之一,病死率约为25%,存活者约半数留下永久性的神经系统后遗症,对人类,尤其是对儿童和老年人危害特别严重。大规模的疫苗接种是该病的主要防制措施。但现有乙型脑炎疫苗,无论是灭活疫苗还是弱毒活疫苗都存在一定的缺陷,所以研制安全、高效、廉价的新型疫苗成为越来越多研究者关注的焦点。本研究通过适当修饰的杆状病毒表达系统介导乙脑病毒主要的免疫原性蛋白E蛋白在哺乳动物体内的表达,并对该重组杆状病毒所诱导的抗原特异性免疫反应以及对致死性乙脑病毒的保护力进行评价。具体研究内容如下:1.表达JEV E蛋白的重组杆状病毒的构建用BglⅡ和NotⅠ双酶切真核表达质粒pc-E,获得CMV-E表达框并插入到用BamHⅠ和NotⅠ双酶切的转移载体pFast-VSV-G中,构建重组转移质粒pFast-G-E。将转移质粒pFast-G-E转化DH10Bac大肠杆菌,通过蓝白斑菌落及抗性筛选,获得重组穿梭载体Bacmid-G-E。利用脂质体介导转染法,将提取的重组Bacmid-G-E DNA转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒BV-G-E。将扩增得到的高滴度的重组病毒转导PK-15细胞,并通过间接免疫荧光实验和western blotting分析证实E基因在哺乳动物细胞中得到了表达。2.重组杆状病毒BV-G-E的免疫原性研究将重组病毒分别以不同的剂量(1010pfu/mL、109pfu/mL、108pfu/mL,100μL/只)肌肉注射免疫小鼠,分别从体液免疫反应和细胞免疫反应方面对其免疫效果进行了评价,并与常规DNA疫苗pc-E进行了比较。试验结果表明,重组杆状病毒BV-G-E各剂量组诱导小鼠产生的ELISA抗体水平和中和抗体水平均显著高于DNA疫苗pc-E组,并且重组杆状病毒的免疫剂量越高,所产生的抗体水平也就越高。细胞免疫反应水平表现出与体液免疫反应水平相似的趋势,BV-G-E 1010pfu/mL免疫组的诱导小鼠脾细胞产生的IFN-γ水平显著高于其它免疫组。3.重组杆状病毒BV-G-E对致死性乙脑强毒的免疫保护力研究利用致死性乙脑病毒对首免6周后各免疫组小鼠进行腹膜内攻毒,3周内观察各组小鼠存活率,结果表明:各免疫小组中,重组杆状病毒BV-G-E 1010pfu/mL免疫组的存活率最高,达到80%,显著高于DNA疫苗pc-E组（50%）。另外,为了更进一步分析重组杆状病毒BV-G-E是否能够有效抑制JEV突破血脑屏障进入小鼠脑组织,我们用荧光定量PCR法检测各组存活小鼠脑组织中的JEV相对含量,结果显示,BV-G-E1010pfu/mL免疫组小鼠脑组织中JEV的含量极显著低于其他各免疫组。由此看来,不管是免疫反应水平还是免疫保护力,重组杆状病毒BV-G-E 1010pfu/mL免疫组均表现出最佳效果,有望发展成为一种新型的乙脑候选疫苗。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表（Abbreviation）
• 第一章 文献综述
• 1.1 乙脑的历史及流行病学
• 1.1.1 乙脑的历史
• 1.1.2 乙脑的流行病学
• 1.2 乙脑的病原学特性
• 1.2.1 病毒的分类及理化特性
• 1.2.2 乙脑的生物学特性
• 1.2.3 致病机制
• 1.3 乙脑病毒的分子生物学特性
• 1.3.1 基因结构与功能
• 1.3.2 蛋白质
• 1.3.2 非结构蛋白
• 1.4 乙脑的诊断方法
• 1.4.1 病原学诊断
• 1.4.2 血清学诊断
• 1.4.3 其他诊断方法
• 1.5 乙脑的防治
• 1.6 乙脑疫苗研究进展
• 1.6.1 乙脑传统疫苗
• 1.6.2 乙脑新型疫苗
• 1.7 杆状病毒表达载体研究进展
• 1.7.1 杆状病毒表达系统简介
• 1.7.2 杆状病毒作为哺乳动物细胞表达载体的研究
• 1.7.3 杆状病毒作为哺乳动物细胞表达载体在疫苗研究中的应用
• 第二章 研究目的和意义
• 第三章 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 毒株、细胞与菌种
• 3.1.2 载体与质粒
• 3.1.3 主要药品及试剂
• 3.1.4 本研究中所用的寡核苷酸引物
• 3.1.5 主要培养基及其配制
• 3.1.6 缓冲液
• 3.1.7 实验动物
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 限制性内切酶酶切反应
• 3.2.2 PCR产物或酶切产物的电泳检测
• 3.2.3 PCR或酶切产物的回收与纯化
• 3.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）
• 3.2.5 连接产物的转化
• 3.2.6 质粒的小量制备（改良的碱裂解法）
• 3.2.7 质粒的大量制备（碱裂解法）
• 3.2.8 脂质体介导转化法（Lipfectin2000,Invitrogen Corp.）
• 3.2.9 构建重组杆状病毒的操作流程
• 3.2.10 重组穿梭载体（Bacmid）的构建
• 3.2.11 重组穿梭载体（Bacmid）的提取
• 3.2.12 重组杆状病毒获得
• 3.2.13 重组杆状病毒转导PK-15细胞
• 3.2.14 间接免疫荧光试验（IFA）检测目的蛋白的体外表达
• 3.2.15 Western blot检测目的蛋白的体外表达
• 3.2.16 杆状病毒介导的表达JEVE的重组毒疫苗动物试验
• 3.2.17 E-ELISA方法的建立
• 3.2.18 微量中和试验
• 3.2.19 小鼠脾淋巴细胞的分离
• 3.2.20 实时荧光定量PCR检测免疫小鼠脾细胞中的IFN-γ相对表水平
• 3.2.21 IFN-γ的定量检测（双抗体夹心ELISA）
• 3.2.22 实时荧光定量PCR检测攻毒小鼠脑组织内JEV相对含量
• 3.2.23 统计学方法
• 第四章 结果与分析
• 4.1 表达JEV E基因的DNA疫苗pc-E的构建
• 4.1.1 真核表达质粒pc-E的构建
• 4.1.2 pc-E介导E基因在哺乳动物细胞中的表达
• 4.2 表达JEV E蛋白的重组杆状病毒BV-G-E的构建
• 4.2.1 转移载体pFast-G-E的构建
• 4.2.2 重组穿梭载体（bacmid-G-E）的构建
• 4.2.3 重组杆状病毒BV-G-E的获得
• 4.2.4 重组杆状病毒BV-G-E介导E蛋白在哺乳动物中的表达情况
• 4.2.5 重组杆状病毒BV-G-E的纯化与毒价的测定
• 4.3 重组杆状病毒BV-G-E的小鼠免疫试验
• 4.3.1 免疫小鼠的ELISA抗体水平
• 4.3.2 免疫小鼠的中和抗体水平
• 4.3.3 实时荧光定量PCR检测免疫小鼠脾细胞中IFN-γ mRNA表达
• 4.3.4 ELISA法检测免疫小鼠脾细胞分泌的IFN-γ水平
• 4.3.5 杆状病毒BV-G-E对致死性JEV的保护率
• 4.3.6 实时荧光定量PCR检测攻毒小鼠脑组织中JEV含量
• 第五章 讨论与结论
• 5.1 讨论
• 5.1.1 VSV-G对杆状病毒载体的修饰
• 5.1.2 杆状病毒转导哺乳动物细胞的方法
• 5.1.3 重组杆状病毒诱导的免疫反应
• 5.1.4 重组杆状病毒对致死性乙脑强毒的保护力
• 5.2 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录