KAI1基因siRNA沉默对胰腺癌细胞转移作用的研究

论文摘要

研究背景与目的高度恶性和转移是胰腺癌的突出特征之一。一旦确诊,其中80%的患者已属晚期,5年生存率仅有1%～4%,平均生存时间五个月,且从60年代至今发病率增加1～5倍。目前,尚无有效的控制方法。导致这种结果可能与胰腺癌的发生、增殖、浸润及转移有关,而其发病可能涉及多阶段、多基因的异常改变。因此,从分子水平阐明胰腺癌的转移机制具有重要的理论及临床应用价值。Kang ai 1（简称KAI1,中文名是抗癌1号）是较新发现的一个肿瘤转移抑制基因。该基因属于膜糖蛋白结构不同的跨膜4超家族（transmembrane 4 superfamily,TM4SF）,与其它TM4SF成员一样是通过肿瘤细胞间或肿瘤与细胞外基质的作用,影响肿瘤细胞的侵袭及转移能力。1996年,Guo等首先在Cancer Res报道了KAI1与胰腺癌转移的关系。但是,对KAI1基因抑制胰腺癌细胞转移的分子机制并不清楚。本项目拟在已有研究的基础上,通过RNA干扰技术阻断胰腺癌细胞系中KAI1基因的功能表达,进一步阐明KAI1调节胰腺癌细胞迁移的作用机制,为临床上KAI1基因治疗胰腺癌等肿瘤提供理论及实验依据。方法针对KAI1基因（CD82）序列,设计四个RNA干扰靶点序列,构建KAI1基因RNA干扰慢病毒载体。以脂质体2000转染T3细胞,测定病毒滴度。按实验设计的分组加入RNAi慢病毒颗粒进行目的细胞的感染实验。采用实时-PCR的方法检测目的蛋白的mRNA表达情况,进而判断不同靶点的干扰效果;采用Transwell测定siRNA沉默KAI1基因前后癌细胞迁移能力变化;采用免疫荧光方法检测siRNA沉默KAI1基因前后癌细胞MMP-9,ICAM-1及β-catenin的表达变化。结果:1.通过建立KAI1靶序列及构建siRNA慢病毒载体,将其导入高表达KAI1的胰腺癌细胞内;采用实时PCR检测KAI1的mRNA表达,结果实验组与阴性对照组及空白对照组比较均有显著性差异（p<0.05）,而空白对照组与阴性对照组相比无明显差异（p>0.05）。2.采用Transwell测定癌细胞迁移能力,siRNA封闭KAI1的实验组胰腺癌细胞的迁移能力与空白载体对照组和阴性对照组相比显著增强（p<0.05）。3.免疫荧光方法证实siRNA沉默KAI1基因后与沉默前相比,胰腺癌细胞的MMP-9和ICAM-1表达明显增高;且胰腺癌细胞Wnt传导通路中β-catenin表达亦显著增高。结论:应用RNA干扰技术可有效抑制胰腺癌细胞KAI1基因表达;siRNA沉默KAI1基因后,胰腺癌细胞中MMP-9和ICAM-1表达明显增高,说明siRNA沉默KAI1基因后可通过增加ICAM-1的表达来加强胰腺癌细胞与基底膜的黏附性,通过增强MMP-9的表达来促进基底膜分解,进而导致胰腺癌细胞迁移能力提高。同时,siRNA沉默KAI1基因后能够上调胰腺癌细胞Wnt传导通路中β-catenin表达。综上所述,KAI1基因可能是通过降低胰腺癌细胞中MMP-9,ICAM-1及β-catenin的表达来抑制肿瘤转移。本结果为KAI1基因的基础与临床治疗奠定了部分理论及实验基础。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 文献回顾
• KAI1 基因 siRNA 沉默对胰腺癌细胞转移功能作用的研究
• 实验一 目的基因RNA干扰慢病毒载体制备
• 1. 材料
• 2. 实验方法
• 3. 实验结果
• 实验二 RNAi 慢病毒小量包装
• 1 材料
• 2. 实验方法
• 3. 实验结果
• 实验三 RNA干扰有效靶点筛选RT-PCR筛靶
• 1. 材料
• 2. 实验方法
• 3. 实验结果
• 实验四 RNAi 沉默 KAI1 基因后胰腺癌细胞功能测定
• 1. 实验材料
• 2. 实验方法
• 3. 实验结果
• 4. 讨论
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢