论文摘要
研究背景及目的重症肌无力（myasthenia gravis,MG）是主要累及神经肌肉接头处突触后膜上乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor,AChR）,主要由乙酰胆碱受体抗体（acetylcholine receptor antibody,AChRab）介导、细胞免疫（cell-mediated immunity,CMI）依赖、补体参与的自身免疫性疾病（autoimmune disease,AID）。大量文献证实MG患者外周血T淋巴细胞亚群异常,经AChR刺激后细胞因子的产生也有异常变化,这些结果表明MG患者存在细胞免疫和体液免疫的异常。同时,由于70%-80%MG患者胸腺异常（包括胸腺增生和胸腺瘤）,而且胸腺切除术是有效治疗MG的手段之一,因而MG与胸腺异常有关成为共识。抗原特异性T细胞的活化需要两个不同的信号。其中,第一信号来自抗原肽—MHC（major histocompatibility complex,主要组织相容性复合体）分子组成的复合物与TCR（T cell receptor,T细胞受体）的相互作用;第二信号由抗原递呈细胞（antigen presenting cells,APC）表面表达的共刺激分子传递给T细胞。近十几年的研究表明,共刺激信号可促进T细胞生长、分化和细胞因子的产生,以及为防止T细胞发生凋亡提供生存信号。更重要的是,由于共刺激信号可以成为增强或终止免疫应答的一种手段,因而已日益受到关注。近年来新发现的共刺激途径B7-H1/B7-DC-PD-1对已经活化的效应性T细胞具有重要的调节作用。B7-H1因为能够通过与T细胞表面不同的特异性受体结合调节T细胞的分化和激活作用,因而成为新近研究热点。一方面,B7-H1可以在抗CD3抗体或异种抗原刺激下与相应的配体PD-1结合促进人T细胞增殖和促进IL-10分泌。另一方面,如用B7-H1刺激T细胞,可抑制TCR介导的细胞增殖和细胞因子IL-2、IL-4、IL-10和IFN—γ的产生,导致细胞周期停止。B7-H1在这种T细胞应答中发挥负向调控作用。本研究利用免疫组化、分子生物学和流式细胞术（flow cytometry,FCM）等实验手段,对MG患者胸腺组织进行B7-H1表达的检测,并检测B7-H1/B7-DC-PD-1共刺激信号通路分子的表达处于异常状态,提示异常的共刺激信号与MG密切相关。研究B7-H1/B7-DC-PD-1共刺激信号通路对MG患者细胞免疫的调控作用,探讨该信号传导通路在MG发生中的作用,可为诊断、预防和治疗MG提供依据。方法无菌取临床确诊的21例重症肌无力（MG）患者和10例先天性心脏病患者切除的胸腺组织,分别进行如下实验:1.制作冰冻切片,免疫组化方法检测胸腺组织中B7-H1分子的表达;2.提取胸腺组织总RNA,RT-PCR分别扩增B7-H1、B7-DC、PD-1和内参β-actin基因,1.2%琼脂糖凝胶电泳,利用Quantity One（?）4.6.3凝胶图像分析软件,测定B7-H1、B7-DC、PD-1和内参β-actin基因电泳条带灰度值,计算B7-H1、B7-DC、PD-1基因条带灰度值与相应标本β-actin基因条带灰度值的比值,作为该例标本目的基因mRNA的相对表达量。利用统计学软件SPSS11.0,比较目的基因在MG患者和正常对照胸腺组织的表达情况;3.机械分离胸腺细胞,采用流式细胞术检测胸腺细胞表面B7-H1分子的表达。结果1.免疫组化结果显示:MG组与正常组相比较B7-H1蛋白表达明显减少,表达量差异具有统计学意义（χ2=4.19,p＜0.05）。2.采用成组资料t检验,MG组（n=21）B7-H1mRNA相对表达水平为0.394±0.258,和对照组（n=10,0.144±0.144）相比,差异有统计学意义（P＜0.05）。MG组（n=21）B7-DCmRNA表达水平为0.710±0.080,和对照组（n=10,0.647±0.058）相比,差异无统计学意义（p＞0.05）。3.成组设计两样本t检验比较,MG患者中不同病理分型的B7-H1 mRNA和B7-DC mRNA的表达水平之间差异无明显统计学意义。其中增生型和萎缩型之间两者p值分别为0.057和0.822,按照检验水准α=0.05,差异无显著统计学意义。4.流式细胞仪检测结果表明,MG组和对照组胸腺细胞表面均表达B7-H1分子,与正常对照组胸腺细胞B7-H1分子表达阳性率（n=11,33.48±2.05）相比较,伴胸腺瘤MG组B7-H1分子表达（n=2,40.09±1.98）显著增高,胸腺萎缩组（n=5,32.17±1.79）则变化不大,而增生型MG组B7-H1分子的表达（n=14,21.22±126）明显降低。结论1.MG患者共刺激途径B7-H1/B7-DC-PD-1分子表达存在异常;增生型MG患者胸腺细胞B7-H1明显降低,而B7-H1mRNA表达明显增高,表明该共刺激通路分子表达过程中存在转录后调控;2.共刺激途径B7-H1/B7-DC-PD-1分子在各种类型胸腺组织均可检出的结果表明,胸腺组织中存在T淋巴细胞活化后的调控。