论文摘要
蚊虫是传播人类多种疾病的重要媒介害虫,如登革热和黄热病、乙型脑炎、疟疾、丝虫病等。对蚊虫进行有效防治以减少蚊媒病的传播和死亡率,一直是世界卫生组织工作重点。目前对蚊虫的防治主要依靠生物防治、化学防治以及环境防治等相结合的综合治理措施。但由于生物防治和化学防治中杀虫剂的广泛使用及滥用,使得蚊虫不仅对杀虫剂产生不同程度抗性,而且也加快了蚊虫体内抗性基因的进化速度。本文以揭示蚊虫抗性机制为主要研究目的,着重从以下几方面对蚊虫体内三大解毒酶家族基因进行研究。第一,P450单加氧酶、谷胱甘肽-S-转移酶与羧酸酯酶做为昆虫抵御外来有毒物质防御系统的重要组成部分,是参与昆虫体内杀虫剂代谢与抗性过程的主要酶。它们在生物体内执行多种功能,如羧酸酯酶的水解功能。其功能多样性取决于其序列的差异性。本文用Mega 3.0聚类软件对致倦库蚊三类酶家族基因分别进行系统进化分类研究,将80条羧酸酯酶基因归类到A-N 14个分类单元；将35条GST归类到Delta、Epsilon、Omega、Sigma、Theta、Zeta等6个分类单元；将198条P450序列归类到CYP3、CYP4、CYP6、CYP9、CYP2和线粒体（mitochondrial）5个分类单元。同时得到这些基因的具体分类和进化信息,这不仅有助于对这些基因的功能研究,而且为探索蚊虫抗性机制研究提供理论依据。第二,新一代测序技术的发展壮大,使得低成本、高通量、快速、精确且全面地分析基因转录情况成为可能。本文选用卵、幼虫、蛹、成虫四个不同发育阶段的有机磷抗性蚊虫品系为研究材料,进行体内总RNA表达测序分析与比较,从而筛选出阶段特异性表达基因（其中卵期：1076个；3龄幼虫：545个；蛹：465个；成蚊：580个）和差异性表达基因（幼虫／卵：3217个；蛹／卵：2885个；成蚊／卵：3491个）。为进一步了解这些阶段特异基因和差异表达基因的功能和所参与的代谢途径,我们对这些基因进行详细的GO分析和Pathway富集分析。最后,我们对四个发育阶段80个羧酸酯酶基因、35个GST以及198个P450基因表达情况分别进行监测并构建基因表达谱图。结果发现,仅50个羧酸酯酶基因、29个GST和138个P450基因被监测到有表达。其余基因可能不表达或表达量极低而未被检测到。第三,原位杂交是定位目的基因在生物体内表达部位的经典技术之一。将地高辛标记的核酸探针与石蜡包埋的致倦库蚊组织切片中羧酸酯酶mRNA、谷胱甘肽-S-转移酶nRNA、P450s mRNA信息进行杂交,即可得到这些基因在蚊虫生物体内表达部位。本文采用此技术将羧酸酯酶家族2个代表性基因体内表达明确定位到卵巢、脑、神经节、中肠等部位。这为研究羧酸酯酶基因在生物体内的表达模式、作用部位和抗性机制提供可靠的实验依据。第四,对蚊虫组织形态学的认识是开展众多领域研究的基础。本文采用改进的石蜡切片法和HE染色,结合活体内脏器官解剖及光学显微镜观察,从形态学和组织学水平对致倦库蚊Culex pipiens quinquefasciatus组织结构做详尽展示,结果获得了结构完整、染色清晰、定位准确的消化排泄系统、生殖系统、神经系统等HE染色石蜡切片,并探讨了改进制片和染色过程中一些步骤及注意事项。研究结果对利用原位杂交、免疫组化等方法研究蚊虫体内抗药性基因的准确定位及基因功能分析提供了可靠的基础。通过研究致倦库蚊成虫组织结构及形态,为媒介蚊虫的抗药性研究及有效防治提供基础材料。