白念珠菌磷脂酶与对氟康唑耐药关系的实验研究

论文摘要

白念珠菌是人类最常见的条件致病性真菌,亦是院内感染的主要病原菌。目前,念珠菌感染性疾病呈日趋增高趋势,且念珠菌血症的病死率居高不下,深部白念珠菌感染病死率可高达67.9%,白念珠菌感染已成为院内感染特别是免疫缺陷病患者最主要死因之一。随着抗真菌药物的大量应用,真菌耐药的情况变得越来越严重,特别是对常用唑类药物的耐药,有研究显示15.5%乃至更高的白念珠菌对氟康唑耐药,这给有效控制日益增高的念珠菌感染带来严峻挑战。白念珠菌耐药与其毒力因子之间存在重要关系,耐药株通常较敏感株毒力强。研究发现耐药基因CDR1断裂突变的白念珠菌毒力明显下降,毒力增强的耐药菌株可有耐药基因CDR和MDR的过度表达。且念珠菌菌丝相形成能力和耐药之间存在一种正相关关系。随着白念珠菌对氟康唑耐药性的出现,其分泌蛋白酶和磷脂酶等毒力因子的能力亦同时增加。因此研究白念珠菌毒力因子与耐药发生间的关系,降低念珠菌毒力与致病性,防止念珠菌耐药的发生,最终有效控制念珠菌感染是21世纪面临的重大科研任务。念珠菌致病性与其毒力因子密切相关,念珠菌通过黏附来识别宿主,通过其利于侵入的酶增强毒力,通过形态发生及酵母相与菌丝相之间的转换使其利于侵入宿主,并对该微生物的适应性有利。因此,念珠菌毒力因子包括黏附素、利于侵入的酶、形态发生及表型转换等。其中细胞外磷脂酶是念珠菌入侵组织的重要毒力因子,它作用于分子中不同酯健,使甘油磷脂形成溶血磷脂从而引起组织细胞损伤。磷脂酶包括A、B、C、D四种类型,磷脂酶A有促进白念珠菌引发炎症的作用,磷脂酶C和D与白念珠菌表型转换和信息传递有关,磷脂酶B主要通过分解宿主细胞膜磷脂而引起膜的通透性增高和完整性受损,继而促进白念珠菌的早期入侵。磷脂酶B又分为磷脂酶B1和磷脂酶B2,磷脂酶B1是一种分泌型糖蛋白,分子量为84KD,由605个氨基酸组成,它同时具有水解酶和溶血磷脂转酰酶的活性,研究发现一个PLB1基因敲除的白念珠菌菌株在体外产生的磷脂酶减少且致病性降低,PLB1是念珠菌致病所必需的毒力因子。唑类抗真菌药物主要通过抑制14α-去甲基化酶活性作用影响14α去甲基化,从而使麦角固醇的合成受阻,导致真菌细胞膜的完整性受损而发挥抗真菌作用。患者的细胞免疫功能缺陷,药物的反复应用,机体的感染状况及可能存在的耐药遗传性等相关因素均可诱导耐药的发生。唑类的耐药机制主要包括药物流出泵的过度表达,药物靶酶的突变和过度表达,生物被膜的形成及念珠菌细胞内滤泡对药物分子的扣押机制等。但亦有研究发现有些MIC值较高的菌株,毒力因子的活性却降低。毒力高的菌株所致感染易于控制,而毒力低的菌株对FCZ的治疗出现耐药。念珠菌耐药与其毒力因子间存在复杂的相互关系,目前,有关念珠菌磷脂酶与耐药发生关系的研究报道国内外并不多见,国内报道通过诱导使白念珠菌耐药,进而研究比较耐药菌株、诱导耐药菌株、敏感菌株磷脂酶、蛋白酶活性及致病性强弱的报道。而从分子水平研究磷脂酶B与耐药的关系目前还是空白。本研究拟通过M27-A方案筛选白念珠菌耐药菌株和敏感菌株,研究其磷脂酶活性和致病性的不同,并进一步研究两组磷脂酶B1的mRNA和蛋白表达的不同,为磷脂酶在耐药发生中的作用提供研究基础,以期最终能够有效控制念珠菌耐药和感染的发生。目的:1.通过蛋黄平板法研究白念珠菌耐药菌株和敏感菌株磷脂酶活性的差异。2.通过动物毒力试验比较白念珠菌耐药菌株和敏感菌株致病性的强弱。3.通过RT-PCR比较研究两组间磷脂酶B1转录水平mRNA表达的差异。4.通过Western blot法比较研究两组间磷脂酶B1蛋白表达水平的差异。方法:1.白念珠菌氟康唑耐药菌株与敏感菌株的筛选实验用白念珠菌均分离自山东大学齐鲁医院门诊患者,经血清芽管试验、厚壁孢子试验和YBC酵母鉴定卡鉴定试验证实为白念珠菌。根据NCCLS制订的M27-A方案中的操作步骤进行药敏试验,氟康唑药物浓度范围0.125μg/mL-64μg/mL,接种菌量为0.5-2.5×103CFU/mL,35℃培养48h判定结果。2.磷脂酶活性的测定制备5×107CFU/mL菌悬液,微量移液器移取配好的菌悬液10μL滴于蛋黄平皿表面,每株菌测定两份,将平皿密封后置35℃培养48h观察结果。测量菌落直径及沉淀圈直径,利用菌落直径与沉淀圈直径的比值（Pz值）来定量表示磷脂酶的活性,Pz=菌落直径/总直径（菌落直径+沉淀圈直径）,Pz值愈低,菌株磷脂酶活性就愈强,Pz值=1.0时表示磷脂酶活性阴性。3.耐药菌株与敏感菌株对小白鼠致病性的对比研究清洁级小白鼠30只,随机分成耐药组和敏感组,每组15只。制备敏感菌株和耐药菌株茵悬液,浓度为1-1.5×107CFU/mL。分别于尾静脉注射感染小鼠,注射菌量为0.2mL,观察30d内小鼠存活天数,计算比较两组小鼠的死亡率和平均存活期。4.RT-PCR检测耐药菌株与敏感菌株磷脂酶B1 mRNA的表达应用E.Z.N.A Yeast RNA Kit试剂盒提取白念珠菌总RNA,具体步骤样严格按照说明书进行。分光光度计测定A260/A280,检测其浓度和纯度。以5‘—TCACCAACGCCATAAGTCC—3’,5’-CATCTTCTTCAACAGCAGCTTG-3’为磷脂酶B1引物,EFB1为内参照,进行逆转录反应和PCR扩增反应,PCR反应条件:95℃预变性5min,95℃变性45sec,58℃退火45sec,72℃延伸45sec。35个循环扩增目的基因,72℃终延伸7min。取10μLPCR产物,1.5%琼脂糖凝胶电泳20min,EB显色,Gel Dos 2000凝胶图像系统成像,Molecular Analyst图像分析软件分析扩增条带的亮度,磷脂酶B1 mRNA表达的相对系数=目的基因强度/EFB1基因强度。5.Western blot检测耐药菌株和敏感菌株磷脂酶B1蛋白表达的不同实验用菌株接种于50mL改良YPD培养基中,接种菌量为6×106CFU/mL,35℃、200rpm摇床培养12h。离心吸取上清液过滤,盐析法提取胞外蛋白,P0013B强R1PA裂解液裂解提取细胞内蛋白质,BCA法测定蛋白质浓度。SDS-PAGE凝胶电泳后电转移至硝酸纤维素薄膜上,封闭液室温下振荡封闭2h。分别加入一抗（1:500内参照β-actin抗体、1:3000磷脂酶B1抗体）与胞外磷脂酶B1蛋白、胞内磷脂酶B1蛋白及β-actin结合,在培养皿中4℃反应过夜,洗膜液洗膜。分别加入HRP标记的抗鼠二抗（1:1250）反应液,室温下振荡反应2h,洗膜液洗膜。应用ECL试剂盒显影、定影。凝胶成像系统成像。用TotalLab1.0软件进行半定量分析各条带的相对吸光值,以各目的条带的IOD与β-actin的IOD比值代表其蛋白的相对表达量。结果:1.药敏试验结果与生长对照孔相比将浊度被抑制80%以上孔的药物浓度判定为MIC值,筛选出氟康唑耐药菌株（MIC＞64μg/mL）及敏感菌株（MIC＜8μg/mL）各15株。2.耐药组和敏感组磷脂酶活性比较15株耐药菌中12株产生特异沉淀圈,磷脂酶阳性率为80.0%,Pz值为0.786±0.055;敏感菌株中7株产生特异沉淀圈,阳性率为46.7%,Pz值为0.913±0.078。统计学检验两者磷脂酶活性有显著性差异,P＜0.01,耐药菌株磷脂酶活性明显强于敏感菌株。3.耐药组和敏感组小鼠平均存活期比较耐药组小鼠30d内死亡12只,敏感组小鼠30d内死亡6只。耐药组和敏感组小鼠的死亡率分别为80%和40%。两组小鼠死亡率和平均存活天数之间的差异有统计学意义,P＜0.05。耐药菌株对小鼠的致病性明显强于敏感菌株。4.耐药菌株与敏感菌株磷脂酶B1 mRNA表达水平的比较提取白念珠菌总RNA,检测OD260/OD280比值在1.8-2.0范围内,总RNA浓度和纯度符合试验要求。RT-PCR逆转录扩增耐药菌株和敏感菌株磷脂酶B1基因和内参照EFB1基因片段,扩增产物符合相应目的基因片段大小,预期目的基因片段大小约311bp。Molecular Analyst软件分析并计算耐药菌株和敏感菌株磷脂酶B1的mRNA相对表达强度,统计学检验显示耐药组和敏感组磷脂酶B1mRNA表达有显著性差异,P＜0.05,耐药菌株磷脂酶B1 mRNA表达强于敏感菌株。5.Western blot比较白念珠菌耐药菌株和敏感菌株磷脂酶B1蛋白表达水平以β-actin为内参照,白念珠菌耐药菌株胞内和胞外PLB1蛋白相对表达量为0.4145±0.2773和0.2720±0.2194,敏感菌株为0.1825±0.1831和0.0688±0.0631。耐药菌株胞内和胞外PLB1蛋白表达水平均高于敏感菌株,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论:白念珠菌耐药菌株毒力因子磷脂酶的活性、菌株致病性、磷脂酶B1转录及翻译水平的表达均强于敏感菌株。白念珠菌磷脂酶与其耐药的发生可能存在一定相关性。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• 第一部分:白念珠菌氟康唑耐药菌株及敏感菌株的筛选
• 材料和方法
• 结果
• 第二部分:白念珠菌氟康唑耐药菌株和敏感菌株磷脂酶活性的检测比较
• 材料和方法
• 结果
• 第三部分:耐药组和敏感组白念珠菌对小白鼠致病性的研究
• 材料和方法
• 结果
• 第四部分:应用RT—PCR对白念珠菌耐药菌株和敏感菌株磷脂酶B1mRNA表达的比较研究
• 材料和方法
• 结果
• 第五部分:应用Western blot对白念珠菌耐药菌株和敏感菌株磷脂酶B1蛋白表达水平的比较研究
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附表
• 附图
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表的论文目录
• 英文论文一
• 英文论文二