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普通小麦（Triticum aestivum L.）抗白粉病相关基因的克隆与分析

2020-11-22阅读(282)

普通小麦（Triticum aestivum L.）抗白粉病相关基因的克隆与分析

论文摘要

白粉病（Blumeria graminis f.sp.tritici）是影响小麦生产的主要病害之一。培育抗病品种是控制小麦白粉病经济、有效的途径。中国农业科学院作物科学研究所重点实验室培育的小麦抗白粉病近等基因系（Mardler/7×百农3217）含Pm2基因,该基因对北京地区流行的白粉菌15号生理小种（其毒力型为E09）表现免疫,对Pm2基因及抗白粉病相关基因的克隆研究不仅有利于阐明抗病机理,而且对小麦抗白粉病育种研究具有重要价值。本研究以cDNA-AFLP为研究方法,通过差异显示获得与抗病相关的基因片段,利用生物信息学的方法获得相关片段基因的全长,通过序列分析和半定量RT-PCR表达分析其是否可能与抗病相关,以期获得抗白粉病相关的候选基因。 利用cDNA-AFLP技术在小麦抗白粉病近等基因系Mardler/7×百农3217中获得了283差异显示片段。此研究以小麦抗白粉病近等基因系Mardler/7×百农3217（Pm2）及其感病轮回亲本百农3217为试验材料,分别设置:Mardler/7×百农3217接菌处理、Mardler/7×百农3217水处理（对照）、百农3217（DCINA预处理）接菌处理、百农3217接菌处理和百农3217水处理（对照）,分别于接种后0、1、3、6、12、24小时采集叶片,用于cDNA-AFLP差异显示;同时将留下的另一部分用于抗性鉴定。利用553对引物筛选出46对差异较好的引物,46对引物差异显示获得283条差异显示片段;抗病鉴定结果Mardler/7×百农3217表现免疫、百农3217DCINA处理表现部分抗病性、百农3217表现高感。 用电子延伸和RT-PCR技术获得一条全长基因。二次PCR获得80条扩增片段,选择性测序获得54条序列,生物信息学分析发现了4条可能与抗病相关的基因片段。通过电子延伸获得一条电子延伸序列,设计引物获得651bp的扩增片段,序列分析发现此序列与LTP基因完全匹配,对获得的LTP基因分别于不同基因组间和表达谱之间进行了分析,发现该基因不存在内元,该基因包括348bp的开放读码框,编码116个通读的蛋白氨基酸序列。 小麦中已知的脂质转运蛋白（LTP）及其前体基因有LTP1、LTP2、LTP3和LTP1500。根据测序获得的一个小麦cDNA片段,通过同源比对发现其包含小麦LTP1完整的编码序列。根据该序列设计引物分别从六倍体小麦（ABD）Mardler/7×百农3217、百农3217;二倍体材料乌拉尔图UR102（A）、拟斯卑尔脱Y2049（B）、粗山羊草Y125（D）和四倍体材料野生二粒小麦DS105（AB）的cDNA中克隆到相应的LTPs基因。通过测序分析初步研究了该基因在二倍体、四倍体以及六倍体材料中的存在情况,并发现了一个新的LTP基因类型。在白粉菌胁迫3小时、300mM NaCl胁迫3小时、16.1%PEG（6000）胁迫6小时,该基因在抗病材料Mardler/7×百农3217中呈上调表达,推测LTP在胁迫早期即参与了小麦白粉病抗性以及抗逆反应。低温胁迫6小时,该基因的表达未发生变化。该基因的表达存在组织特异性。

论文目录

  • 1 引言
  • 2 抗白粉病近等基因系的差异表达分析
  • 2.1 材料与方法
  • 2.1.1 材料及处理
  • 2.1.2 总RNA提取
  • 2.1.3 cDNA的合成
  • 2.1.4 cDNA-AFLP的操作步骤
  • 2.1.5 聚丙烯酰胺凝胶的制备及电泳
  • 2.1.6 扩增片段的克隆
  • 2.1.7 克隆片段的测序
  • 2.1.8 DNA star 分析软件的使用方法
  • 2.2 实验结果
  • 2.2.1 总RNA的质量检测
  • 2.2.2 抗病近等基因系接菌后的发病情况
  • 2.2.3 白粉菌诱导后小麦的cDNA-AFLP差异表达分析
  • 2.2.4 二次PCR扩增的效率及质粒提取效果
  • 2.2.5 序列的产生与序列分析
  • 2.3 讨论
  • 2.3.1 关于cDNA-AFLP技术的应用
  • 2.3.2 采样时间点的选择
  • 2.3.3 对化学诱导的分析
  • 2.3.4 对接菌诱导表达的分析
  • 3 小麦脂质转运蛋白（LTP）基因的cDNA克隆及表达分析
  • 3.1 材料与方法
  • 3.1.1 材料
  • 3.1.2 处理设置
  • 3.1.3 试验方法
  • 3.2 结果分析
  • 3.2.2 LTP基因编码序列在小麦族A、S、AB、D以及ABD基因组间的比较分析
  • 3.2.3 LTP基因在白粉菌胁迫下的表达分析
  • 3.2.4 LTP基因在非生物胁迫下的表达分析
  • 3.2.5 LTP基因在小麦不同组织中的表达分析
  • 3.3 讨论
  • 3.3.1 关于电子克隆技术应用的讨论
  • 3.3.2 脂质转运蛋白在抗逆作用中的探讨
  • 4 结论
  • 5 参考文献
  • 6 附录
  • 附录I 试剂配制
  • 附录II 附图
  • 附录III 试验流程图
  • 附录IV 扩增引物序列表
  • 在读期间发表的论文
  • 作者简历
  • 致谢

    • 相关论文文献

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