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人类膜蛋白p75NTR/BNIP3L与p75NTR/BFAR相互作用及其生物学功能的初步研究

2020-12-11阅读(384)

人类膜蛋白p75NTR/BNIP3L与p75NTR/BFAR相互作用及其生物学功能的初步研究

论文摘要

神经生长因子（nerve growth factor, NGF）是神经营养因子家族成员之一,与神经系统的发育、分化和生存密切相关。NGF有两种受体,分别是高亲和力受体TrkA和低亲和力受体p75NTR,两者都是Ⅰ型单跨膜蛋白,分布在多种细胞表面。TrkA是酪氨酸蛋白激酶（tyrosine kinase）家族成员之一,与NGF发生特异性结合,调控细胞的发育、增殖和分化。p75NTR是肿瘤坏死因子受体（TNFR）家族成员,其胞外区包含四个Cys富集结构域,胞内区含有一个死亡结构域。p75NTR可与神经营养因子家族中的所有成员（NGF。BDNF、NT3、NT4、NT5）结合。p75NTR能够与高亲和力受体TrkA协同作用促进细胞存活,另一重要功能是诱导细胞凋亡,通过与细胞内配体结合,介导死亡信号,目前p75NTR下游配体研究还不是很清楚,其是如何行使诱导凋亡的机制还有待进一步研究。神经生长因子是神经系统的正常发育所必需的分子,其是通过与细胞膜表面的受体结合而起作用的,进而维持神经系统的健康。本研究以p75NTR为主要对象,为了更好的发现p75NTR新的相互作用蛋白,采用新型膜蛋白酵母双杂交系统—DUALmembrane system筛选人胎脑cDNA文库,初步发现了38个与p75NTR相互作用的蛋白,并构建了膜蛋白酵母双杂交筛选平台。DUALmembrane system是利用蛋白泛素化降解的特点和可分离的泛素两部分互补来检测膜蛋白相互作用的,含有三个报告基因（HIS3、ADE2和LacZ）,最突出的特点是可用于筛选或检测整合蛋白、膜相关蛋白间的相互作用,并且可以检测发生翻译后修饰的蛋白间相互作用。新发现的互作蛋白中,BNIP3L和BFAR引起了我们的关注,接下来我们对p75NTR与BNIP3L及p75NTR与BFAR这两对相互作用进行了深入研究。BNIP3L （Bcl-2/EIB19kDa-interacting protein3-like）,是Bcl-2家族成员,BNIP3的同族体。分布在内质网膜上,含有两个功能结构域,凋亡效应结构域（bcl-2homologue3, BH3）和跨膜结构域（transmembrane, TM）,属于BH3only促凋亡家族,能与Bcl-2、Bcl-xL、E1B19K等抗凋亡蛋白相互作用,促进细胞凋亡我们通过膜蛋白酵母双杂交共转试验、GST-PULL DOWN和CO-IP试验证实p75NTR与BNIP3L在体外、体内能够发生相互作用,发现p75NTR胞内区是与BNIP3L发生相互作用的关键区域,p75NTR胞外区则不与BNIP3L发生相互作用。BNIP3L与p75NTR可共定位于细胞质中。同时,在双荧光素酶检测试验中发现PC-12细胞中转染BNIP3L后p53信号通路活性上调了4.5倍。没有NGF存在情况下,p75NTR和BNIP3L共转染PC-12细胞能够促进凋亡反应发生；NGF刺激PC-12后大大消弱凋亡信号。RNAi BNIP3L能降低p75NTR诱导的细胞凋亡作用。由此我们推测BNIP3L可能是p75NTR基因行使凋亡功能的过程中能与其结合的一个配体。研究p75NTR与BNIP3L这对蛋白间相互作用对揭示p75NTR诱导凋亡的分子机理具有一定提示作用。双功能凋亡调节子（Bifunctional apoptosis regulator, BFAR）是一个能够抑制凋亡信号通路的蛋白,它是一个多结构域的蛋白,包含4个可识别结构域（RING、 SAM、DED、TM）,功能主要是阻碍Fas介导外部凋亡通路和Bax诱导的内部凋亡通路。BFAR能够对抗凋亡从而起到保护细胞的作用。我们通过膜蛋白酵母双杂交共转验证试验、GST-PULL DOWN和CO-IP试验对p75NTR与BFAR在体外、体内能够相互作用的特异性进行了验证,荧光共定位试验发现两者可共定位于细胞质中。此外,荧光素酶检测试验中我们发现在PC-12细胞中高表达BFAR能够抑制NF-KB和JNK信号通路。cell cycle试验中发现转染BFAR使细胞周期中G2/M期细胞含量增多,S期细胞减少。FACS检测细胞凋亡试验中发现p75NTR和BFAR共转染组与对照组相比没有促进凋亡的作用。BFAR与p75NTR是一对功能拮抗的相互作用蛋白,进一步研究BFAR与p75NTR互作是如何介导神经细胞自我保护的机制,可能可以提供一个治疗神经退行性疾病药物靶点的新线索。

论文目录

  • 目录
  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第—部分 p75NTR相互作用蛋白的筛选及其与BNIP3L相互作用的初步研究
  • 1、前言
  • 2、材料与方法
  • 3、结果
  • 3.1 p75NTR基因序列分析
  • 3.2 p75NTR基因钓取
  • 3.3 用膜蛋白酵母双杂交系统筛选与p75NTR相互作用的蛋白
  • 3.3.1 膜蛋白酵母双杂交系统特点
  • 3.3.2 pBT3-SUC-p75NTRds载体构建
  • 3.3.3 pBT3-SUC-p75NTR自激活检测和功能验证
  • 3.3.4 pBT3-SUC-p75NTRds筛库合适筛选压力测试
  • 3.3.5 膜蛋白酵母双杂交筛库
  • 3.3.6 阳性克隆的回转验证
  • 3.3.7 阳性克隆DNA测序和序列比对
  • 3.4 p75NTR与BNIP3L相互作用的研究
  • 3.4.1 BNIP3L基因回复突变及p75NTR与BNIP3L酵母双杂交验证
  • 3.4.2 GST pull-down体外蛋白相互作用结果
  • 3.4.3 p75NTR与BNIP3L相互作用区段的确定
  • 3.4.4 p75NTR和BNIP3L在细胞内免疫共沉淀结果
  • 3.4.5 p75NTR和BNIP3L的细胞内荧光共定位结果
  • 3.5 p75NTR和BNIP3L相互作用对细胞周期的影响
  • 3.6 转染BNIP3L对细胞不同信号通路的影响
  • 3.7 p75NTR与BNIP3L共转染能够促进细胞凋亡
  • 3.8 NGF能抑制p75NTR与BNIP3L共转染介导的细胞凋亡作用
  • 3.9 siRNA使BNIP3L表达量下降
  • 3.10 干扰BNIP3L消弱p75NTR介导的细胞凋亡作用
  • 4、讨论
  • 4.1 膜蛋白酵母双杂交系统研究方法比较
  • 4.2 膜蛋白酵母双杂交系统研究与p75NTR基因相互作用的蛋白
  • 4.3 p75NTR与BNIP3L存在相互作用
  • 4.4 p75NTR与BNIP3L相互作用能促进细胞凋亡
  • 5、小结
  • 6、参考文献
  • 第二部分 p75NTR与BFAR相互作用的初步研究
  • 1、前言
  • 2、材料与方法
  • 3、结果
  • 3.1 p75NTR与BFAR相互作用的研究
  • 3.1.1 BFAR全长片段获取及p75NTR与BFAR酵母双杂交验证
  • 3.1.2 p75NTR与BFAR可以在体外直接相互作用
  • 3.1.3 p75NTR和BFAR在细胞内直接相互作用结果
  • 3.1.4 p75NTR和BFAR在Hela细胞中的亚细胞共定位
  • 3.2 过表达BFAR对不同信号通路的影响
  • 3.3 BFAR对细胞周期的影响
  • 3.4 p75NTR与BFAR对细胞凋亡的影响
  • 4、讨论
  • 5、小结
  • 6、参考文献
  • 总结
  • 综述 p75NTR与其介导的细胞凋亡研究进展
  • 参考文献
  • 缩略词表
  • 研究细间获得奖励
  • 研究生期间发表论文
  • 毕业致谢及感言

    • 相关论文文献

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