论文摘要
目的:马钱子碱（Brucine）为吲哚型生物碱,是马钱子的主要有效成份之一。本研究旨在观察Brucine对人乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖抑制和诱导凋亡作用,并分析Brucine在诱导细胞凋亡过程中对Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表达的调控作用,为Brucine用于乳腺癌的临床治疗提供实验依据。方法:人乳腺癌细胞株MDA-MB-231（雌激素受体阴性）以L-15培养基孵育,至对数生长期时,分别以Brucine刺激24h、48h和72h,Brucine浓度为50mg/L、100mg/L、200 mg/L、400 mg/L。用MTT法测定Brucine对细胞的增殖抑制作用;倒置显微镜观察细胞形态;Brucine处理结束后,收集细胞制成单细胞悬液,加入碘化丙啶（PI）后以流式细胞仪分析细胞周期并计算凋亡率的变化:加入AnnexinV-FITC和PI后以流式细胞术分析细胞凋亡。为检测Bcl-2、Bax和Caspase3分子在Brucine诱导乳腺癌细胞凋亡过程中的作用,以中和性抗体进行阻断实验。为检测Brucine作用后Bcl-2、Bax和Caspase3蛋白水平的变化,以50mg/L、100mg/L、200 mg/L、400 mg/L的Brucine处理乳腺癌细胞48h后,裂解乳腺癌细胞后收集蛋白并进行定量分析,经聚丙烯酞胺凝胶电泳分离蛋白后以半干式电转移将蛋白转移到硝酸纤维素膜上,以Western蛋白印迹法检测Bcl-2、Bax和Caspase3蛋白水平。结果:（1）细胞形态学观察结果:空白对照组细胞贴壁均匀,状态良好,各干预组贴壁细胞明显减少,培养液内细胞碎片增多,且随着药物剂量的增加和干预时间的延长更明显。（2）MTT比色试验结果:各剂量组OD值较空白对照组显著降低（P＜0.01）,而且与干预剂量、干预时间成反比,有显著统计学差异（p＜0.01）。（3）PI流式细胞仪检测结果:随着Brucine浓度的增加和作用时间的延长细胞凋亡率逐渐增高并呈明显的浓度、时间依赖,与对照组相比差异有显著性（P＜0.05）;同时S期细胞逐渐减少,G0/G1期细胞逐渐增多（P＜0.05）,细胞被阻滞在G1/S期。（4）Annexin V—FITC/P1分析结果:与空白对照组相比,各干预组早期调亡细胞所占比例显著增加（p＜0.01）,各剂量组间也有显著差异（p＜0.01）。（5）Western blotting检测结果:作用48h后,各剂量组与空白对照组相比,抗凋亡基因Bcl-2表达水平明显降低,而促凋亡基因Bax明显增高,凋亡执行因子中Caspase-3表达增加。结论:Brucine能够有效的抑制乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞的增殖,呈明显浓度、时间依赖;Brucine能够诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡,其分子机制可能与激活Bax及抑制Bcl-2等凋亡调控基因有关;Bcl-2的表达降低有可能诱发Caspase-3激活,促使细胞凋亡。