syk基因真核表达载体的构建及其对乳腺癌细胞侵袭性抑制作用的体外研究

论文摘要

目的:肿瘤是严重威胁人类健康的重大疾病,其中乳腺癌是女性发病率最高的一种恶性肿瘤,并呈逐年上升趋势,严重威胁着广大妇女的身心健康。乳腺癌的发生和发展是一个复杂、多步骤的过程,与许多基因和蛋白质的表达密切相关,包括原癌基因的激活（如HER2/neu）、抑癌基因的突变和丢失（如p53）等。几十年来,对乳腺癌发生、发展和转移过程中的基因改变和功能分析一直是该领域研究的焦点。蛋白酪氨酸激酶（PTKs）是一组能催化底物蛋白酪氨酸残基磷酸化的酶蛋白,参与许多信号转导途径,在控制细胞分化、增殖和扩散中起重要作用。Syk是一种非受体型蛋白酪氨酸激酶,表达于正常乳腺腺体和上皮组织,可以促进乳腺上皮细胞生长。近来发现,Syk是乳腺癌细胞生长和转移中重要的抑制因子,在非侵袭性乳腺癌细胞表达降低,而在侵袭性乳腺癌细胞中则表达明显降低或缺失。Syk表达降低或缺失与正常乳腺组织向恶性发展有关,但是,Syk抑制肿瘤细胞侵袭性生长的具体机制尚不清楚。本研究将syk基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1D/V5-His-TOPO中,在脂质体作用下转染Syk表达缺失的MDA-MB-231细胞,检测该基因诱导的细胞功能改变,为进一步探讨Syk抑制肿瘤细胞侵袭转移的具体机制奠定基础。方法:1构建syk基因的真核表达载体提取人乳腺癌细胞MDA-MB-468总RNA,RT-PCR扩增syk编码序列基因片段,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1D/V5-His-TOPO中。经PCR扩增、ApaⅠ酶切及DNA测序鉴定,证实pcDNA3.1D/V5-His-TOPO/syk真核表达载体构建成功。2转染人乳腺癌细胞以脂质体介导法将pcDNA3.1D/ V5-His-TOPO/syk真核表达载体转染Syk缺失的人乳腺癌细胞MDA-MB-231,经G418筛选,构建syk基因稳定表达的细胞株MDA-MB-231/syk,通过Western blot和RT-PCR技术,验证Syk在转染后的乳腺癌细胞中的表达情况。3 VEGF和MMP-9的表达分析用流式细胞术和半定量RT-PCR技术检测3组细胞:转染syk cDNA组细胞（MDA-MB-231/syk）、转染空载体组细胞（MDA-MB-231/ pcDNA3.1）和未转染组野生型细胞（MDA-MB-231）中VEGF和MMP-9的表达情况。4细胞增殖实验MTT法检测MDA-MB-231/syk、MDA-MB-231/pcDNA3.1和MDA-MB-231细胞的生长增殖能力,绘制生长曲线。5细胞迁移和侵袭能力检测用体外迁移和侵袭力实验测定MDA-MB-231/syk、MDA-MB-231/pcDNA3.1和MDA- MB-231细胞的迁移和侵袭能力。结果:1成功构建了pcDNA3.1D/V5-His-TOPO/syk真核表达载体。2 MDA-MB-231/syk细胞稳定表达Syk蛋白。3 MDA-MB-231/syk细胞较MDA-MB-231/pcDNA3.1和MDA-MB-231细胞表达VEGF和MMP-9的水平显著降低。4 MDA-MB-231/syk细胞生长增殖能力无改变,但迁移和侵袭能力均下降。结论:候选抑癌基因syk可以通过脂质体有效转染人乳腺癌细胞MDA-MB-231,syk基因转染后的细胞迁移和侵袭能力明显降低,这为进一步研究Syk在体内的抑瘤作用和乳腺癌基因治疗奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 syk 基因真核表达载体的构建及其对乳腺癌细胞侵袭性抑制作用的体外研究
• 引言
• 第一部分 syk 基因真核表达载体的构建
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 Syk 对乳腺癌细胞增殖与侵袭能力的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述 新型候选抑癌基因syk 的研究进展
• 致谢
• 个人简历