海南杂草双生病毒的分子鉴定及病毒致病性研究

论文题目: 海南杂草双生病毒的分子鉴定及病毒致病性研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物化学与分子生物学

作者: 熊庆

导师: 周雪平

关键词: 双生病毒,中国黄花捻黄花叶病毒,假马鞭曲叶病毒,中国胜红蓟黄脉病毒,沉默抑制子

文献来源: 浙江大学

发表年度: 2005

论文摘要: 双生病毒能够侵染多种经济作物,并给作物生产造成极大的损失,在我国的云南、广西和广东等省份的作物上已发现了多种双生病毒。为进一步了解双生病毒在我国的分布及危害情况,本论文对侵染海南杂草的双生病毒进行了分子鉴定及致病性研究。从海南儋州表现黄花叶的黄花捻上采集到病毒样本Hn8、Hn40和Hn41,部分序列测定表明,它们为同一种双生病毒。对其中的Hn8分离物进行了DNA-A全长基因组的序列测定,全长为2749个核苷酸(nt)。Hn8与中国胜红蓟黄脉病毒(AJ558120)的相似最高(78%),而与其他双生病毒的同源性较低,表明Hn8是一种新病毒,命名为中国黄花捻黄花叶病毒(Sida yellow mosaic China virus,SiYMCNV)。在SiYMCNV分离物Hn8及Hn40和Hn41中还发现伴随有卫星DNAβ分子,序列测定表明Hn8、Hn40及Hn41的卫星DNAβ分子基因组全长分别为1346 nt,1341 nt和1346 nt(AJ810093-95),它们之间的序列相似性较高(高于84%),但与其它病毒的DNAβ分子差异较大,其中与胜红蓟黄脉病毒的DNAβ的相似性最高(47.8%)。从海南海口表现曲叶的假马鞭上分离到了双生病毒,并对Hn30和Hn34两分离物进行了全长基因组序列测定,序列分析表明Hn30及Hn34与假马鞭曲叶病毒(Stachytarpheta leaf curl virus,StaLCV)分离物Hn5-4和Hn6-1有较高的相似性(高于93%),表明它们为StaLCV的分离物。在假马鞭样品中,均没有发现DNA-B或DNAβ。构建了StaLCV-[Hn5-4]DNA-A侵染性克隆并对其致病性进行了测定,发现单独接种Hn5-4 DNA-A即可在寄主植物上诱导产生典型的双生病毒病症状。对Hn5-4 DNA-A在寄主植物中与不同病毒的卫星DNAβ分子的互作进行了研究,结果表明Hn5-4能够支持不同DNAβ分子在本氏烟中的复制并能诱导产生不同的症状。对采自海南症状表现为黄脉的胜红蓟样品上的双生病毒进行了研究,序列分析表明胜红蓟样品中的双生病毒都为中国胜红蓟黄脉病毒(Ageratum yellow vein China virus,AYVCNV)。在所有胜红蓟样品中都没有发现DNA-B组份,但发现了AYVCNV与DNAβ分子的重组分子(RecDNA-Aβ),根据RecDNA-Aβ分子中DNAβ的序列,设计引物对胜红蓟样品中可能存在的DNAβ进行了PCR扩增,结果在所采的样品中都能扩增到1.3kb的条带,对其中的Hn9、Hn12和Hn19分离物的1.3kb条带进行了序列测定,经与其它DNAβ分子比较,发现这些DNAβ分子与AYVV的DNAβ的相似性最高(高于79.6%)。分别构建了AYVCNV-[Hn2]和Hn19 DNAβ的侵染性克隆,致病性测定表明,单独接种Hn2 DNA-A不能诱导寄主产生症状,而将Hn2与Hn19 DNAβ混合接种

论文目录:

致谢

摘要

Summary

第一章文献综述

第一节双生病毒的分类及其致病机理

1 双生病毒的危害

2 双生病毒科的分类、基因组特征及寄主范围

3 双生病毒的侵染过程及与寄主植物的互作

4 双生病毒与小分子DNA形成的病害复合体

5 双生病毒的进化

6 问题与展望

第二节病毒对RNA沉默的抑制

1 RNA沉默及其机制

2 RNA沉默是植物天然的抗病毒反应

3 病毒编码的RNA沉默抑制子

4 沉默抑制子的机制及作用方式

5 沉默抑制子的鉴定方法

6 沉默抑制子与病毒引起症状之间的关系

7 问题与展望

第二章材料与方法

1.材料

1.1 植物材料

1.2 病毒侵染性克隆

1.3 菌株和质粒

1.4 试剂与仪器

1.5 常用缓冲液的配制

2.方法

2.1 三抗体夹心酶联免疫吸附法

2.2 PCR技术

2.3 PCR产物纯化

2.4 DNA克隆技术

2.5 重组质粒的提取与鉴定

2.6 植物总DNA提取和Southern印迹分析

2.7 植物总RNA的提取

2.8 RT-PCR和半定量PCR技术

第三章中国黄花捻黄花叶病毒及其伴随的DNAβ的基因组结构

1.材料与方法

1.1 毒源

1.2 抗原表位谱的TAS-ELISA测定

1.3 植物总DNA的提取及病毒DNA-A全长基因组的克隆和序列测定

1.4 DNA-B组份的检测

1.5 DNAβ的扩增及克隆测序

1.6 序列分析

2.结果与分析

2.1 病毒的抗原表位谱测定

2.2 Hn8分离物的DNA-A基因组结构及序列分析

2.3 DNAβ的基因组结构及序列分析

3.讨论

第四章侵染假马鞭的双生病毒的致病性测定

1.材料与方法

1.1 毒源

1.2 植物总DNA的提取及病毒DNA-A全长基因组的克隆和序列测定

1.3 DNA-B和DNAβ的检测

1.4 序列分析

1.5 侵染性克隆的构建

1.6 农杆菌介导的植物接种

1.7 病毒DNA的检测

2.结果与分析

2.1 病毒分离物的基因组结构及序列分析

2.2 田间样品中DNA-B及DNAβ的检测

2.3 Hn5-4 DNA-A的致病性及寄主范围测定

2.4 Hn5-4与DNAβ的互作

3.讨论

第五章中国胜红蓟黄脉病毒及其伴随的DNAβ的致病性测定

1.材料与方法

1.1 毒源

1.2 植物总DNA的提取及病毒基因组的克隆和部分序列的测定

1.3 田间样品中DNA-B和DNAβ分子的检测

1.4 RecDNA-Aβ分子的检测与DNAβ分子的克隆

1.5 序列分析

1.6 侵染性克隆的构建

1.7 农杆菌介导的植物接种

1.8 病毒DNA的检测

2.结果与分析

2.1 病毒分离物的基因组结构和序列分析

2.2 DNA-B与DNAβ的检测

2.3 RecDNA-Aβ的序列分析

2.4 DNAβ基因组结构和序列分析

2.5 Hn2 DNA-A与DNAβ的致病性测定

2.6 Hn2与不同DNAβ分子的互作

3.讨论

第六章假马鞭曲叶病毒和中国胜红蓟黄脉病毒的C4是RNA沉默抑制子

1.材料与方法

1.1 植物材料

1.2 质粒和菌株

1.3 载体构建

1.4 农杆菌浸润接种

1.5 GFP荧光观察和拍照

1.6 RNA的提取

1.7 RT-PCR及半定量PCR检测

2.结果与分析

2.1 Hn5C4和Hn2C4的植物病毒载体和瞬时表达载体的构建

2.2 Hn5C4和Hn2C4是致病的决定因子

2.3 Hn5C4和Hn2C4是RNA沉默的抑制子

3.讨论

全文小结

参考文献

附录A：论文所用病毒缩写及中英文对照

附录B：本论文所用缩写词及中英文对照

附录C：常用试剂的配制

附录D：常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器

发布时间: 2005-07-22

参考文献

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[5].云南番茄双生病毒鉴定及烟草曲茎病毒致病分子机理研究[D]. 李正和.浙江大学2005
[6].双生病毒卫星DNA的βC1基因缺失突变体的致病性及稳定性测定和缺失突变体的利用[D]. 钱亚娟.浙江大学2005
[7].四种双生病毒的分子鉴定[D]. 郭小建.浙江大学2006
[8].广西双生病毒的分子鉴定[D]. 徐幼平.浙江大学2006
[9].三种双生病毒及其伴随卫星DNA的致病性研究[D]. 郭维.浙江大学2008
[10].我国五种双生病毒的分子鉴定及致病性研究[D]. 吴剑丙.浙江大学2008

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