论文题目: 猪戊型肝炎病毒结构蛋白基因表达及其基因特异性噬菌体展示肽库构建
论文类型: 博士论文
论文专业: 预防兽医学
作者: 赵宇军
导师: 相文华
关键词: 猪戊型肝炎株,原核表达,核酸疫苗,噬菌体肽库构建
文献来源: 中国农业科学院
发表年度: 2005
论文摘要: 猪戊型肝炎(swine HE)是一种新发现的人畜共患病。该病于1997年首次在美国发现,由于该次发现的病毒与美国当地的人戊型肝炎病毒基因组同源率非常高,达到97%,因此对其的人畜共患性提出质疑。而后的动物种间的病毒传播、不同工作人群之间的抗体流行率的差别研究及食用生猪肝后直接引起的人戊型肝炎等研究结果证明猪戊型肝炎是一种新的人畜共患病。国外的研究报道表明猪戊型肝炎的流行非常广泛,不仅在发展中国家普遍存在,而且在发达国家中,猪群中的抗体流行率也很高。我国新疆地区在1988—1989年曾经发生过戊型肝炎的暴发和流行,发病人数达到20多万。目前我国的戊型肝炎流行主要呈散发状态,在华东、华北等地流行的戊型肝炎病毒主要是基因4型。而我国东北也有人戊型肝炎的流行,因此对该地区猪群中戊型肝炎的研究非常必要。 戊型肝炎病毒是一种无囊膜,单链,正义RNA病毒,其生物学特性比较脆弱,而且没有可靠的体外培养系统,目前尚无对该病的诊断方法。国内外通过重组表达的各种蛋白来建立诊断方法,但是均没有理想的结果。 本文利用分子生物学方法对黑龙江省猪群HE流行情况进行了较为详细的调查,并对猪HEVDQ01株排毒猪进行监测,收集其阳性血清;以SOE-PCR方法将DQ01ORF2拼接完整,对其进行遗传演化分析;通过原核表达获得重组蛋白,进行了免疫反应性的鉴定,初步建立了该毒株的ELISA检测方法;以pcDNA3.1为载体构建了DQ01结构蛋白核酸疫苗,并免疫Bal B/C小鼠,获取免疫血清。采用双基因噬菌体展示系统,构建了DQ01ORF2特异性肽库。试验结果表明DQ01ORF2系统发育关系与长春人戊型肝炎病毒最近达到87%,氨基酸残基同源率达到97%;将拼接完整的ORF2命名为DQ01ORF2,以DNAStar分析其抗原性及水溶性片段,以pET32a为载体,将DQ01结构蛋白部分片段进行原核表达,经SDS-PAGE电泳和Western blot分析,该蛋白得剑表达并具有一定的抗原性,将该蛋白命名为DQ01Ag01,以DQ01Ag01为诊断抗原,建立的ELISA方法对黑龙江省6个猪场的血清学检验表明该方法与RT-PCR检测结果一致。将整个DQ01ORF2构建的核酸疫苗进行Vero转染,以间接荧光免疫反应检测,证明外源片段在细胞内得到瞬时表达,免疫Bal B/C小鼠,共免疫四次,结果表明有20%的小鼠产生了相应的抗体,将构建的核酸疫苗命名为pDQ01ORF2。将DQ01ORF2以DnaseI进行酶切,消化至80bp人小片段,将小片段插入噬菌粒pC89,电击转化至大肠杆菌XL1-Blue,建立了噬菌体展示肽库,经随机性检测、库容量检验,肽库达到筛选抗原表位的要求。以DNA疫苗免疫小鼠产生的阳性血清进行生物淘洗后,将洗脱后的40个单克隆噬菌体与猪HEV阳性血清反应,有23个单克隆噬菌体可以与猪HEV阳性血清产生强烈反应,证明该肽库可以用作猪HEVDQ01农壳蛋白抗原表位的筛选和鉴定。
论文目录:
第一章 引言
1 国内外研究现状
1．1 猪戊型肝炎研究进展
1．2 核酸疫苗研究
1．3 噬菌体展示技术
2．目前存在的问题
3 本研究的目的和意义及技术路线
第二章 研究报告
试验一 黑龙江省猪群戊型肝炎病毒流行及感染猪排毒监测
1 材料方法
1．1 样本
1．2 试剂
1．3 引物、载体和菌株
1．4 阳性猪场选择
1．5 RT-PCR检测猪粪样中戊型肝炎病毒RNA
1．6 感染HEV猪的确定
1．7 隔离饲养及HEV感染猪排毒监测
1．8 阳性血清和阴性血清的采集
2．结果
2．1 RT-PCR检测结果
2．2 检测猪场HEV感染情况及阳性猪场不同年龄检测情况
2．3 HEV感染猪的确定及隔离饲养
2．4 阳性血清与阴性血清的采集
3 讨论
试验二 DQ01部分结构蛋白片段的表达及其免疫学特征鉴定
1．材料
1．1 质粒、表达载体和菌株
1．2 试剂
1．3．猪抗HEV阳性血清
1．4 免疫学器材
2方法
2．1 结构蛋白分析及引物合成
2．2 Ag1表达和抗原性鉴定
2．3 以DQ01Ag01为包被抗原的ELISA方法建立
3、结果：
3．1 选择核酸片段抗原性分析
3．2 PCR结果
3．3 SDS-PAGE分析原核表达结果
3．4 纯化蛋白含量测定及ELISA免疫反应性
3．5 Western blot鉴定结果
3．6 封闭剂选择
3．7 纯化蛋白与血清作用条件选择
3．8 建立的ELISA方法与RT-PCR检测结果的比较
4．讨论
试验三 猪HEV DQ01 ORF2核酸疫苗的构建
1 材料
1．1 载体、感受态细胞和质粒
1．2 转染细胞及试验小鼠
1．3 试剂及主要检测设备
2 试验方法
2．1 引物设计及合成
2．2 片段的扩增及纯化回收
2．3 拼接顺序
2．4 拼接片段测序
2．5 DQ01结构蛋白编码基因的系统进化分析及编码蛋白同源性分析
2．6 核酸疫苗引物设计及DQ01ORF2插入片段制备
2．7 核酸疫苗构建
2．8 重组质粒对Bal B／C小鼠的免疫及抗体检测
3 结果
3．1 SOE-PCR拼接片段的扩增
3．2 拼接产物测序与原ORF2比较
3．3 DQ01ORF2与我国、日本和美国发表的戊型肝炎病毒ORF2比较
3．4 DQ01ORF2片段的制备
3．5 重组pDQ01ORF2鉴定及测序
3．6 转染用质粒及免疫用质粒的提取
3．7 休克时间的确定
3．8 间接免疫荧光反应结果
3．9 pDQ01ORF2免疫小鼠结果
4 讨论：
试验四 HEV DQ01 ORF2特异性噬菌体展示肽库的构建
1 材料
1．1 质粒、噬菌体与菌
1．2 试剂
2 方法
2．1 DQ01ORF2随机片段的制备
2．2．噬菌粒载体的制备
2．3 重组噬菌粒的制备
2．4 电击转化感受态细胞的制备
2．5 电击转化条件确定
2．6 连接产物的电击转化
3 结果：
3．1 DQ01随机片段的制备结果
3．2 载体噬菌粒pC89处理结果
3．3 电击转化条件的确定
3．4 连接产物的电击转化结果
3．5 转化子随机性与大小的确定
3．6 淘洗的产率
4 讨论
1．影响库容量的因素
2．噬菌体与噬菌粒
3．淘洗用血清的影响
结论
参考文献
致谢
作者简介
发布时间: 2005-09-05
参考文献
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- [2].戊型肝炎流行病学和戊型肝炎病毒全基因克隆与表达研究[D]. 朱光泽.吉林大学2007
- [3].戊型肝炎病毒流行病学及其感染机理探索研究[D]. 屈勇刚.吉林大学2008
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- [8].肠道传播肝炎病毒的黏膜免疫研究[D]. 高燕.中国疾病预防控制中心2015
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